2)砂土孢子:砂:土=2:1,过80目筛,湿热灭菌(121℃,0.1MPa,1h),干热灭菌(160℃,0.1MPa,1h),处理两次以上。
埋孢子,抽真空一天,使水分小于4%,再放冰箱冷藏保存(2~6℃)。
3)母斜制备:用涂布法进行接种,培养温度37℃,培养10天,再冷藏保存,保存温度2~6℃,保存3个月左右。
4)子斜制备:是对母斜进行扩大,也是用涂布法进行接种,培养温度7℃,培养9天,再冷藏保存,保存温度2~6℃,保存3~7个月。
5)孢悬液制备:15个子斜进一个一级种子罐,在孢悬液进入种子罐之前要先进行处理,消毒方法是:有培养基的在121℃,0.1MPa,灭菌25~30分钟,用具、无培养基的在121℃,0.1MPa,湿热灭菌1h,再在160℃,0.1MPa,干热灭菌1h。 4,发酵部分
1)一级种子罐
将茄子瓶中的孢悬液用压差法进行接种,在温度36~37℃,罐压保持在0.07MPa,培养4天,然后用压差法把一级种子罐中的原料移种到二级种子罐中培养。
2)二级种子罐
由一级种子罐移种过来的原料在温度34±1℃,罐压0.05MPa下培养1天,再用压差法移种到发酵罐中发酵。
3)发酵
发酵罐要求温度维持在34±1℃,罐压0MPa,发酵4天。发酵完成,取样检测合格后,再进入提取工序。
4)发酵工序中罐之间移种条件 ①从一级种子罐到二级种子罐 菌丝形态:团状,周边散开; 菌丝量:60%~70%。
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②从二级种子罐到发酵罐 菌丝形状:网状; 菌丝量:大于90%。 5)中间检测
在整个发酵过程中,需要定时取样检测,检测方法一般为化学检测和生物测定。主要检查糖、氨基氮和PH三个参数。
化学测定: ①糖测定
用碘量法检测糖的含量,方法如下:先将培养液进行过滤,吸0.5ml滤液置于碘量瓶中,加5ml蒸馏水、5ml HCl,加热煮沸3min,冷却后加3滴酚酞,用30% NaOH中和呈红色,加斐林试剂10ml,加热煮沸,冷却后加H2SO4 7.5ml,以0.1N的Na2S2O3 标准液滴至溶液呈淡黄色,加淀粉指示剂1ml滴至兰色刚褪去即可。
②氨基氮测定
2ml滤液加水10ml、加甲基红指示剂3滴,用H2SO4调成红色,放置5min,用0.02858 N 的NaOH调成橙色,加中性甲醛3ml,滴3滴酚酞试剂摇匀放10min,用0.02858N的NaOH调成橙红色即可。
③PH测定
PH值可以直接用PH计来测定。 生物测定:
生物测定中标准品是硫酸小诺霉素,指示菌是枯草芽孢杆菌。
用管碟法测生物效价,标准品是硫酸小诺霉素,指示菌是短小芽孢杆菌。 6)无菌压缩空气的制备
空气采集 预处理 压缩 冷却 除油水 加热 总过滤器 预分过滤器 精分过滤器 进罐
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5、提取部分
1)酸化、中和、吸附
①酸化:酸化桶中加HCl,将PH调至1.5~2.0,放置30min;
②中和:酸化完成后,再加入NaOH中和,把PH调至6.4~6.7,在这过程中,在PH=4的时候投入732#阳离子树脂,静态吸附4—6个小时
发酵液净体积×放罐单位(估计效价) 树脂投放量的计算:树脂投放量(体积)=
70000(u/ml)
③最后测废液效价:废液效价﹤30 u/ml
1 2 3 4 51、放罐阀2、纯化水3、树脂4、碱NaOH5、酸HCl酸化桶
2)分离漂洗
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真空管饱和树脂进溢流口饱和树脂输送泵饱和树脂槽3)解析脱色
①饮用水反洗,洗去杂质; ②HCl洗去钙离子和镁离子; ③纯化水正反洗去氯离子; ④稀氨水除去小组分; ⑤5%氨水解析 4)浓缩
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饱和树脂出饮用水
氨水冷凝器旋风分离器薄膜蒸发器蒸汽1废氨罐脱色液薄膜蒸发设备简图
5)转盐炭脱
231、2、3浓缩罐
在炭脱液中加入化学纯浓硫酸,再加活性炭,在温度保持在60~65℃下加热30min。 加活性炭脱色的目的是为了除热原(细菌内毒素),最后得到炭脱液中间体。 6)层析
①配制上样液:炭脱液与20%氨水混合,要求PH﹥13。 ②处理树脂,层析用的树脂是大孔树脂。 ③上样。
④展层:用0.5N氨水洗硫酸根离子,测效价=7500u/ml时,开始收集C1a,用4%酒精氨洗C1a;当C2b:C1a=2:8时改用8%酒精氨洗;C2b:C1a=6:4时,洗C2b。当效价﹤500u/ml
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