大黄中游离蒽醌类成分的提取、分离与鉴定
一、实验目的
1.掌握蒽醌苷元的提取方法--双相酸水减法
2.掌握梯度PH萃取法提取分离大黄中各种蒽醌苷元的原理及操作方法 3.掌握羟基蒽醌类化合物的颜色反应及薄层色谱鉴别方法
二、实验原理
1.提取原理
双向酸水解法，为一相与酸水不相互溶的有机溶剂，另一相为酸水，加热回流水解的方法。由于大黄中的羟基蒽醌类化合物多以苷的形式存在，所以首先要将苷水解成苷元，本实验选用硫酸和乙酸乙酯作为双向酸水解的溶剂，采用加热回流方法，提取大黄药材中的游离蒽醌类化合物。根据苷元不溶于水，可溶于乙醚、乙酸乙酯等亲脂性有机溶剂的性质，即在加热回流提取过程中，稀硫酸可将蒽醌苷元水解成苷元，游离出来的蒽醌苷元随即溶于乙酸乙酯中，从而将蒽醌苷元提取出来。 2.分离原理
pH梯度萃取法 羟基蒽醌类化合物酸性强弱不同，用pH梯度法进行分离。具有羧基或多个β位酚羟基的蒽醌可溶于5%碳酸氢钠溶液；具有一个β位酚羟基的蒽醌可溶于5%碳酸钠溶液；只具有α位酚羟基的蒽醌，酸性弱，只溶于氢氧化钠溶液。以分离酸度不同的蒽醌苷元。也可利用游离蒽醌的极性不同，采用硅胶柱色谱法进行分离。
（1）大黄中游离蒽醌的酸性强弱顺序 大黄酸（-COOH）＞大黄素（β酚-OH）＞芦荟大黄素（醇-OH）＞大黄素甲醚（-OCH3）≈大黄酚（-CH3）
（2）大黄中游离蒽醌的极性大小顺序 大黄酸＞大黄素＞芦荟大黄素＞大黄素甲醚＞大黄酚
大黄酚和大黄素甲醚酸性相近，但极性不同，可用硅胶柱色谱法进行分离。
三、实验方法
1.总蒽醌苷元的提取、分离工艺流程 大黄药材（粗粉）50g
加20%H2SO4 100ml，乙酸乙酯250ml，水浴回流2h，稍冷过滤 乙酸乙酯提取液 药渣 去除下层酸水层，再用蒸馏水水洗2次（50ml/次） 直至乙酸乙酯层pH值呈中性
乙酸乙酯提取液
5%NaHCO3溶液萃取三次（80ml，60ml，40ml） 碱水层 乙酸乙酯层
滴加浓盐酸，调节pH=2，放置 5%Na2CO3溶液萃取三次（40ml/次）
沉淀物（黄色结晶或
黄色絮状沉淀） 碱水层 乙酸乙酯层 沉淀过滤，冰醋酸精制 滴加浓盐酸，调节pH=2，放置 0.25%NaOH溶液萃
黄色结晶（大黄酸） 沉淀物（橙色结晶或 取三次（40ml/次） 橙色絮状沉淀）
沉淀过滤， 碱水层 乙酸乙酯层 丙酮精制 滴加浓盐酸，调 5%NaOH溶液萃 橙色结晶（大黄素） 节pH=2，放置 取三次（40ml/次） 沉淀物 调pH=2,沉淀过滤 （橙色絮状沉淀） 黄色沉淀物 乙酸乙酯层 沉淀过滤，乙酸乙酯精制 硅胶柱色谱
黄色针晶 洗脱剂为石油醚（60-90℃） （芦荟大黄素） -乙酸乙酯（15：1） 大黄酚和大黄素甲醚混合物
2.总蒽醌苷元的提取
大黄粗粉50g，置500ml烧瓶中，加20%硫酸溶液100ml和乙酸乙酯250ml，水浴回流提取2h，放置，冷后过滤，残渣弃去，乙酸乙酯提取液置分液漏斗中，分出酸水层，乙酸乙
酯提取液用蒸馏水洗2次（20ml/次），将乙酸乙酯放置在锥形瓶中，密封。 3.游离蒽醌的分离和精制
（1）将乙酸乙酯提取液置500ml分液漏斗中，用5%NaHCO3溶液萃取三次（80ml，60ml，40ml），合并碱液，在搅拌下滴加浓盐酸，调节pH=2，放置，待沉淀析出完全后，过滤，并用少量水洗沉淀物至洗出液呈中性，60℃干燥，得深褐色粉末，主为大黄素。沉淀干燥后，样品加冰醋酸10ml加热溶解，趁热过滤，滤液放置析晶，过滤，用少量冰醋酸淋洗结晶，得黄色针晶为大黄酸。 （2）大黄素的分离和精制
经NaHCO3 溶液提取的乙酸乙酯液，继用5%NaHCO3 萃取三次，每次用量40ml，合并酸碱，在搅拌下滴加浓盐酸，调节pH=2，析出棕黄色沉淀，抽滤，水洗沉淀物至洗出液呈中性，60℃干燥，沉淀经干燥后，用15ml丙酮热熔，趁热过滤，滤液静置，析出橙色针晶，过滤后，用少量丙酮淋洗结晶，得大黄素。 （3）芦荟大黄素的分离和精制
经Na2CO3提取过的乙酸乙酯液，再用0.25%NaOH溶液提取三次，每次用量40ml，合并后的碱液同（1）法处理。萃取液经酸化后析出黄色沉淀，过滤，水洗至中性，干燥，用10ml乙酸乙酯精制，得黄色针晶的芦荟大黄素。 （4）大黄素甲醚和大黄酚混合物的分离和精制
萃取除去芦荟大黄素后余下的乙酸乙酯层，再用5%NaOH溶液萃取多次（每次100ml），至碱水液呈无色为止，合并碱水层，加盐酸至呈酸性（pH2~3），析出黄色沉淀，过滤，水洗至中性，干燥，为大黄酚和大黄素甲醚的混合物。将此混合物溶于乙酸乙酯，用硅胶柱色谱分离。
（5）柱层析分离大黄酚和大黄素甲醚
? 装柱 取一玻璃层析柱，垂直固定在铁架台上，在管的下端垫入少量棉花，装入100~200
目硅胶（约1/3高，湿法装柱）。
? 上样 将样品置于小蒸发皿中，用少量石油醚分散，另加用3倍量硅胶拌和均匀，并于
水浴上缓缓蒸去溶剂。然后将含有样品的硅胶装入色谱柱的上端，并盖一圆形滤纸。 ? 洗脱 将色谱柱活塞打开，洗脱剂为石油醚（沸程60-90℃）-乙酸乙酯（15:1）混合
液。
? 收集 洗脱液25ml一份，分别收集，回收溶剂至小体积，放置，即可析出结晶，合并
相同晶形部分。先洗脱下的化合物为大黄酚，后洗脱下的化合物为大黄素甲醚。
4.游离蒽醌类化合物的鉴定 （1）化学鉴定
① 碱液试验 分别取各蒽醌结晶少许置于小试管中，加1ml乙醇溶液，加10%氢氧化钠溶液数滴，观察颜色变化。羟基蒽醌应显橙色到蓝紫色。
② 醋酸镁试验 分别取各蒽醌结晶少许置于小试管中，各加乙醇1ml使溶解，滴加0.5%醋酸镁乙醇溶液，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙色到蓝紫色。 （2）色谱鉴定
① 薄层色谱鉴定 吸附剂：硅胶G-CMC-Na板
样 品：上述分别获得的大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄素甲醚和大黄酚的三氯甲烷溶液及各相应对照品的三氯甲烷溶液。 展开剂：石油醚-乙酸乙酯-醋酸（2:1:0.2） 展开方式：上行展开。
显 色：在可见光下观察，记录黄色斑点出现的位置，然后用浓氨水熏成或喷5%醋酸镁甲醇溶液，斑点显红色。
实验结果记录：观察斑点颜色，记录图谱并计算Rf值。 四．数据记录、结果讨论与分析： 1.实验现象
加5% NaHCO3溶液萃取后，收集下层溶液，一天后未发现结晶，使用旋转蒸发仪蒸发后，最终得到黄色絮状大黄酸沉淀。加5% Na2CO3溶液萃取后，最终得到橙色大黄素结晶。加0.25% NaOH溶液萃取后，精制最终得到黄色芦荟大黄素结晶。加5% NaOH溶液萃取后，得到黄色的大黄酚和大黄素甲醚混合物，无法调节pH值分开，故使用柱层析分离。
（1）碱液试验：取各类蒽醌的标准乙醇溶液，滴加10% NaOH后。大黄酸呈红色，大黄素呈粉红色，芦荟大黄素呈红色，大黄酚呈红色。
（2）醋酸镁试验：取各类蒽醌的标准乙醇溶液，滴加0.5%的醋酸镁溶液后，大黄酸呈红色，大黄素呈粉红色，芦荟大黄素呈橘黄色，大黄酚呈橘黄色。 （3）薄层板鉴定
点样次序为：1.2.3.4依次为柱层析洗脱液，5为大黄酚标准液，6为大黄酸标准液，7为大黄酸自制，8为大黄素标准液，9为大黄素自制，10为芦荟大黄素标准液，11为芦荟大黄素自制，12为大黄素甲醚标准液。
测得Rf值：
大黄酸：标准液的Rf值为2.75/6.6=0.42，我组制得产物的数据缺失，图上无明显斑点 大黄素：标准液的Rf值为4.21/6.6=0.64,我组制得产物的Rf值为5.8/6.6=0.88 芦荟大黄素：标准液的Rf值为3.95/6.6=0.60,我组制得产物的Rf值为4.81/6.6=0.73 大黄酚标准液的Rf值为5.65/6.6=0.86,大黄素甲醚标准液的Rf值为5.7/6.6=0.86 柱层析洗脱液1.2.3.4的Rf值依次为6.05/6.6=0.92; 5.9/6.6=0.89; 5.8/6.6=0.88; 5.71/6.6=0.87
2.结果讨论
加5% NaHCO3溶液萃取后，收集下层溶液，一天后未发现结晶，可能与之前加的NaCl溶液
过多，使收集的液体体积过大，大黄酸浓度过低引起，使用旋转蒸发仪蒸发后，最终得到黄色絮状大黄酸沉淀。
蒽醌类与醋酸镁显色反应的必要条件是蒽醌化合物中有α-酚羟基或邻二酚羟基结构。 3.分析
（1）游离蒽醌的提取要控制温度，回流不宜太剧烈。要注意碱液浓度及萃取时的静置时间对实验结果的影响。
（2）
A大黄酸 R1=H R2=COOH B大黄素 R1=CH3 R2=OH C芦荟大黄素 R1=CH2OH R2=H D大黄素甲醚 R1=CH3 R2=OCH3 E大黄酚 R1=CH3 R2=H 酸性：A>B>C>E≈D
本实验采用了 pH梯度萃取法，其原理是由于溶剂系统pH变化而改变了它们的存在状态（游离型或解离型），从而改变了他们在溶剂系统中的分配系数。由于各羟基蒽醌结构上的不同所表现的酸性不同，用pH梯度萃取法分离他们；大黄酚和大黄素甲醚酸性相近，利用其极性的差异，用柱色谱分离之。