2、初代培养物的建立 1）、保证无菌
2）、条件合适：首先, 一定要选择好合适的作物种类、品种及培养的部位; 其次,一定要选择合适的培养基, 激素及其他添加物; 还要注意掌握适宜的环境条件。所以在进行一种植物的组织培养之前, 应查找该种植物有关方面的资料, 根据这种植物过去所采用的培养部位、培养基、培养条件和培养技术等, 再决定自己的工作步骤。 3）、操作技术过关 3、污染的防治
1）、植物材料的选择及防止污染
通常多年生的木本材料比一二年生的草本材料带菌多; 老的材料比幼嫩的材料带菌多; 田间生长的材料比温室生长的材料带菌多; 带泥土的材料比不带泥土的材料带菌多。为此对于培养材料的取材就应很认真地加以选择, 以减少污染的发生。
用茎尖作外植体时, 应在室内或无菌条件下对枝条进行预培养。将枝条用水冲洗干净后插入无糖的营养液或自来水中, 使其发枝, 然后以这种新抽的嫩枝条作为外植体, 便可大大减少材料的污染。或在无菌条件下对采自田间的枝条进行暗培养, 待抽出徒长的黄化枝条时取材, 也可明显地减少污染。
对木本植物等难以消毒的材料可采用多次灭菌法。如将切好的外植体放入1 . 3%次氯酸盐溶液中(商品漂白粉25%的溶液)消毒30min , 然后用无菌水冲洗3 次,
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再放在无菌条件下,次日用2 . 6%次氯酸钠灭菌30min , 然后用无菌水冲洗3 次。也可采用多种药液多次浸泡法,以加强灭菌效果。
材料内部易感染病菌, 在这种情况下, 必须在培养基中加入抗生素类, 防止初代培养物污染。
2）、人为污染的防止
接种前应用肥皂将手仔细洗净后, 再用70%酒精擦洗双手, 并需及时剪除指甲。在工作中特别要注意避免交叉感染, 双手必须清洁, 工具则用一次即需消毒一次。工作人员呼吸所产生的污染, 主要是接种时说话或咳嗽所引起的, 因此, 操作时严禁谈话, 并应戴上口罩, 也应穿工作服, 戴工作帽。
污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染, 这种细胞为芽孢杆菌。法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌( Bacillus lenlus) , 它外被荚膜, 耐高温, 一般消毒剂难以杀死。它可随培养材料、用具等传播; 它可出现在培养基表面, 或呈滴形云雾状存在于培养基内。若出现应严格灭菌, 清洗用具, 更换消毒酒精。 4、防止外植体褐变 1）、褐变的影响因素
褐变是由于组织中的多酚氧化酶被激活, 使细胞的代谢发生变化, 酚类物质被氧化后产生醌类物质, 这类物质呈棕褐色, 它们会逐渐扩散到培养基中, 抑制其他酶的活性, 毒害培养的材料。褐变的影响因素是复杂的, 随植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同而危害的程度也有区别。
材料本身的生理状态不同, 接种后褐变的程度也不同。如在欧洲栗的培养中, 用
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幼年型的材料培养含醌类物质少, 而用成年型材料培养时含醌类物质多。而在卡德利亚兰的培养中, 较短的新生茎致褐物质含量高, 而较长的新生茎致褐物质含量低, 另外致褐物质的含量也因季节的不同而不同, 冬季褐变少, 夏秋季褐变最严重, 存活率最低。在枝条上取芽的时期及所取部位不同也有区别, 如欧洲栗取1 月后半月的芽培养则醌的形成少, 而在5 月～6 月取芽培养则醌类物质发生严重。在第一至第四个芽的生长期单宁类物质合成多, 因此, 接种后褐变也严重。油棕用幼嫩外植体( 如胚)培养较少褐变, 而用高度分化的叶片接种后则容易褐变。总之, 分生部位接种后形成的醌类物质少, 而分化的部位则形成的醌类物质较多。
培养基成分过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化。例如油棕用MS无机盐培养基容易引起外植体的褐变, 而用降低了无机盐浓度的改良MS 培养基时则可减轻褐变, 而且可获得愈伤组织和胚状体。激素使用不当时, 材料也容易褐变。细胞分裂素6 - 苄基氨基嘌呤或激动素有刺激多酚氧化酶活性提高的作用, 这在甘蔗的组织培养中表现十分明显。在外植体最适宜的脱分化条件下, 分生能力强的细胞大量增殖, 酚类的氧化会受到抑制。在芽旺盛增殖时, 褐变也被抑制。此外, 培养条件不适宜, 如温度过高或光照过强, 均可使多酚氧化酶的活性提高, 从而加速被培养组织的褐变。
培养时间过长接种后材料培养时间过长, 未及时转移, 也会引起材料的褐变, 甚至导致全部死亡, 这在培养过程中是经常可见的。 2）、褐变的防止
选择适当的外植体和培养条件： 选择适当的外植体和培养条件是克服褐变的最主要的手段。外植体应有较强的分生能力, 在最适宜的细胞脱分化和再分化的培养条件下, 使外植体处于旺盛的生长状态, 便可大大减轻褐变。
抗氧化剂的作用：在培养基中加入抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮( PVP)、半胱氨酸等抗氧化剂, 或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养, 可减轻醌类物质的毒害。
连续转移：对于易褐变的材料, 进行连续转移, 可以减轻醌类物质对培养物的毒害作用。
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六、试管苗的增殖与继代培养 （一）、加快试管苗的繁殖速度 1、试管苗繁殖类型
试管繁殖类型共有五种：微型扦插型、丛生芽增殖型、器官发生型、胚状体发生型、原球茎发生型，一定要注意其遗传稳定性, 前三种途径一般能保持遗传稳定性。
2、试管繁殖速率及计算
统计试管苗增殖速度, 有以苗为单位, 也有以芽或未生根的小茎作单位的, 以原球茎球状体或胚状体因难以统计, 则以瓶为单位。大多数以芽和苗作单位。 试管苗理论上一年能繁殖多少, 可用下面的简单公式计算: Y = mXn Y = 年繁殖数 m = 无菌母株苗数
X = 每个培养周期增殖的倍数 n = 全年可增殖的周期次数
例如月季每5 周转接一次, 甲品种每次增殖3 倍, 乙品种每次增殖5 倍, 丙品种每次增殖7 倍, 假定一开始都是一个芽, 那么这三个品种一年能繁殖多少呢? 根据公式可知:
n =365d/35d= 10 .4 , 即每年可转接10 次, 那么这三个品种年繁殖率分别计算如下:
甲品种Y = 1×31 0 = 59 000 = 5 .9×104 乙品种Y = 1×51 0 = 9 760 000 = 9 .76×106 丙品种Y = 1×71 0 = 282 000 000 = 2 .82×108
从上可知甲品种每5 周转接一次, 一年可繁殖出5 万多苗, 乙品种每周期增殖5 倍, 一年可得900 多万苗, 而丙品种每周期增殖7 倍, 一年可繁殖出2 亿苗来。 不过实际值远比理论值为低。因为实践中要受到多种因素制约, 困难很多。但理论计算可以作为一个计算产量的指标, 提供参考, 有它的积极意义。 3、提高繁殖速度的方法
不仅试管苗的繁殖类型不同, 而且在试管内又受到基因型、外植体来源、年龄、
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部位、培养基种类、附加成分和培养环境等多种因素的影响, 应通过具体试验来摸索每种植物最快最好的繁殖方法。 1）、改进培养基：
?、不同的植物材料需要使用不同类型的培养基。
?、糖具有维持培养基渗透压的作用，在培养过程中植物组织不断地从培养基中吸收糖，糖浓度降低，当糖浓度不能维持正常渗透压时，材料要转移到新鲜培养基。培养基中的维生素绝大部分为B族维生素，它们一各种辅酶的形式参与植物代谢活动，影响形态发生、分化及试管苗的生长，为防植物缺乏，一般均加入。 ?、植物生长调节物质在试管苗增殖中期决定性作用
A、促进叶芽形成和生长的激素：细胞分裂素抑制了植物的顶端优势，使得叶芽不断分化和生长，逐渐形成芽丛，并促进芽丛生长。大多植物最适用量为1.0~2.0，一般用量0.1~10.0。应用最多的是6-BA,其次KT和2ip，ZT用的较少，因它的价格太贵。对于微型扦插型繁殖可不加细胞分裂素或加0.1以下也可。除了细胞分裂素以外，还可加入低浓度的生长素，以促进叶芽的生长，但要防止愈伤组织化。常用的有NAA,IBA,IAA，浓度在0.1~1.0。
在实际操作中高浓度细胞分裂素和低浓度生长素的配比，既能提高腋芽的增殖速度，也能保证腋芽健壮生长。如果细胞分裂素浓度过高生长素浓度过低，会形成过于细密的嫩芽，虽然提高了增殖速度，但苗多而弱，降低了芽的质量。但如果细胞分裂素过低，生长素过高，影响芽的增殖速度，甚至有时没有侧芽产生。 B、诱导不定芽形成和生长的激素：除现有的芽之外, 任何器官上的, 通过器官发生重新形成的芽称为不定芽。促进外植体形成不定芽, 要使用一定量的细胞分裂素和生长素, 一般浓度不能过高。否则不但使器官分化能力降低, 而且也使遗传性难以稳定。
诱导外植体形成不定芽时, 一般使用细胞分裂素的浓度高于生长素浓度的配比, 但也经常采用细胞分裂素和生长素浓度的比值接近于1 的配比。
C、促进胚状体的形成和繁殖的激素：胚状体途径的优点是增殖率高, 而且同时具有胚根和胚芽, 可免去生根。现在胚状体发生还不普遍或产生的胚状体难以成株或成株率太低, 以及遗传性尚不稳定, 故仅在有限植物中应用。一般是在含有丰富还原氮的培养基上, 加有生长素, 特别是2 , 4 - D 以诱导胚状体的发生,
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