第一章 绪论
1、生物工程：基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程 2、酶工程的概念及其研究内容？
酶工程是从应用目的出发研究酶，在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。是酶的生产和应用的技术过程，它包括酶的生产、酶的分离纯化、酶的改造和酶的应用四个方面。 3、相关知识点
（1）利用酒曲中富含维生素和淀粉酶，可治肠胃疾病；
（2）麦芽酿造啤酒类饮料，是利用麦芽中存在的丰富的淀粉酶和糖化酶； （3）人类游牧生活时期，利用小牛胃液存在的凝乳蛋白酶制造奶酪； （4）早期皮革制造过程中，需要利用粪便中存在的蛋白酶降解非胶原蛋白来软化皮革；皮革的软化剂—阿鲁朋中的活性成分是蛋白酶； （5）制作豆酱利用蛋白酶水解豆类蛋白；。
（6）第一个发现的酶：淀粉酶（植物中）、胃蛋白酶（动物中） （7）有关酶研究的第二次诺贝尔奖是关于从刀豆中分离到脲酶结晶 （8）有关酶研究的第一次诺贝尔奖是关于无酵母的酒精发酵 4、酶在工业上应用限制条件：
（1）大多数酶脱离其生理环境后不稳定 （2）酶分离纯化工艺条件 （3）酶制剂成本较高
第二章 酶抑制剂及反应动力学 1、能降低酶催化反应速度的因素
（1）失活作用：失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂（蛋白变性剂：无选择性）部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。——破坏三维结构
（2）抑制作用：指在酶不变性的情况下，由于抑制剂（具有一定选择性：一种抑制剂只能引起某一种酶或某一类酶活性丧失或降低）导致必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。——降低酶催化效率
（3）去激活作用：某些酶只有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子引起这些酶活性的降低或丧失。——降低底物有效浓度
（4）阻遏作用：阻遏作用指某些因素（如激素或药物等）使细胞内酶蛋白的合成减少，反应速度的降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化效力并无变化。——酶合成受阻 2、抑制程度的表示方法
相对活力分数（残余活力分数）、相对活力百分数（残余活力百分数） 抑制分数：指被抑制而失去活力的分数、抑制百分数 IC50：酶的活性抑制50%时所需的酶抑制剂浓度。 通常所谓抑制率是指抑制分数或抑制百分数。 3、抑制作用的分类
酶的竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制之间的异同点
（1）不可逆抑制作用：抑制剂与酶分子上的某必需基团以共价键结合，使酶失活，不能用透析、过滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。
A非专一性不可逆抑制剂：有些不可逆抑制剂能与酶分子中一类或几类基团反应，称为非专一性不可逆抑制剂。如重金属离子：共价结合巯基、氨基和吲哚基，从而使酶失活。
B专一性不可逆抑制剂：
①Ks型不可逆抑制剂：根据底物的化学结构而设计的抑制剂，具有和底物类似的结构，可以和相应酶相结合，同时所带活泼化学基团化学修饰酶分子中必需基团从而抑制酶的活性。这种抑制剂是通过其对酶的亲和力而对酶进行修饰标记的，所以又称亲和标记试剂。
② Kcat（catalyze)型不可逆抑制剂(自杀性底物)：具有与天然底物相类似的结构，本身也是酶的底物，被酶催化后，潜伏性的反应基团因酶的催化而暴露或活化，作用于酶的活性中心或辅基，使酶被共价修饰而失活。
（2）可逆抑制作用：抑制剂与酶以非共价键结合而引起酶活性的降低或丧失，能用物理的方法除去抑制剂而使酶复活者称为可逆抑制作用。
①竞争性抑制：在反应体系中存在有与底物结构相类似的物质，该物质能在酶的活性部位上结合，从而阻碍了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降。如二氢叶酸合成酶：对氨基苯甲酸→二氢叶酸，其竞争性抑制剂：对氨基苯磺酸。 大多数竞争性抑制剂的结构与底物类似的；抑制程度取决于底物及抑制剂的相对浓度，可通过增加底物浓度而解除抑制。
②非竞争性抑制剂：若抑制剂在酶的底物结合部位以外的必需基团与酶结合，并且这种结合与底物的结合没有竞争关系，这种抑制称为非竞争性抑制作用；抑制作用不能用增加底物浓度来解除；某些重金属离子对酶的作用属于此类抑制。 ③反竞争性抑制剂：抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物ES相结合生成ESI复合物；常见于多底物反应中，单底物反应中比较少见。 （3）可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别：
①物理方法：用透析、超滤和凝胶过滤等方法是否能除去抑制剂来鉴别可逆抑制作用和不可逆抑制作用。
②动力学方法：在测定酶活力系统中加入一定量的抑制剂，测定酶反应的初速度，以初速度和酶浓度作图。
4、酶抑制反应动力学 （1）米氏方程及双倒数作图 V0=Vmax[S]/（Km+[S]）
双倒数图：测定抑制剂如何与酶结合。 （2）
5、酶抑制剂及其制备、应用 （1）、酶抑制剂概念：使酶活性降低乃至完全丧失活性的配体。 （2）简述酶抑制剂的设计和筛选方法
①基于过渡态底物类似物结构进行设计，基于Kcat型不可逆抑制机制进行设计 ②产酶抑制剂的微生物 组合化学法
基于化学合成与计算机技术相结合的组合化学法是酶抑制剂筛选的全新方法,其基本原理是借助组合合成仪，同时合成出大量不同化合物,并通过高通量群集筛选技术得到最有潜力的先导物. 高通量筛选法
高通量筛选法是在传统筛选技术的基础上,将先进的分子生物学,细胞生物学,计算机,自动化控制等多种技术方法有机结合而形成的,更适合酶抑制剂筛选的技术体系,目前已经用于新药的筛选.
b、建立筛选模型
分子水平的药物筛选模型：受体筛选;酶筛选;离子通道筛选.
细胞水平药物筛选模型：细胞调亡;转录调控;信号传导;细菌生长;细菌蛋白分泌 （3）举例阐明酶抑制剂在医药产品和农业中的作用的原理和应用前景
二氢叶酸合成酶催化苯甲酸生成二氢叶酸，二氢叶酸还原酶催化二氢叶酸生成四氢叶酸。四氢叶酸是合成核酸的辅酶。磺胺是苯甲酸的类似物，竞争性抑制二氢叶酸合成酶，造成细菌核酸合成障碍，导致细菌死亡。 以下两个例子任选一个。
EPSP合成酶的生理作用与草甘膦的抑制作用
EPSP合成酶: 5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶。EPSP合成酶是芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的合成酶，芳香族氨基酸参与植物体内一些生物碱、香豆素、类黄酮、木质素、酚类物质等的次生代谢。草甘膦施用后被植物迅速吸收，并随同化产物传导至整个植株，因其阻断了芳香族氨基酸的生物合成，对植物细胞分裂、叶绿素合成、蒸腾、呼吸以及蛋白质等代谢过程产生影响而导致植物死亡（竞争抑制，非选择性）。植物5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶的cDNA克隆，连接CaMV启动子，通过Ti质粒载体导入矮牵牛目前已将这种修饰过的基因导入烟草和矮牵牛，提高除草剂作用靶酶的剂量，并对草甘膦产生了抗性。
谷氨酰胺合成酶(GS)及其抑制剂膦丝菌素GS的生理功能及酶学特征。
谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase(GS)，催化无机氮向有机氮的转化反应，植物体中的GS是将氨固定到有机物当中。膦丝菌素（PPT）的抑制机理是竞争性的与谷氨酰胺合成酶结合，抑制无机氮向有机氮的转化。从链霉菌中克隆编码使膦丝菌素乙酰化而失活的酶的基因Bar基因,连接CaMV启动子，并将其转化到土豆。Bar基因能合成乙酰转移酶，解除非选择性除草剂PPT对植物谷氨酰胺酶的抑制，避免植物细胞因为氨的积累而死亡。目前已将这个基因导入小麦、烟草、马铃薯、甜菜等作物，其中转基因马铃薯已进行大田试验并取得良好效果。 （4）农用除草剂一般为非选择性的，举例阐明转基因植物杀虫、抗除草剂机制。 胆固醇氧化酶基因也被称为第二代抗虫基因，其表达的产物是一类新型杀虫剂。在链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、假单胞菌属（Pseudomonas）、红球菌属(Schizopylium)等细菌中均发现有胆固醇氧化酶。目前已从链霉菌属中分离出胆固醇氧化酶基因，其编码的胆固醇氧化酶属于乙酰胆固醇氧化酶家族的成员，可催化胆固醇形成17-酮类固醇和过氧化氢。胆固醇是细胞膜的主要组分，伴随着上述反应，摄食昆虫的肠道表皮细胞出现胞溶现象，由此导致昆虫死亡。
谷氨酰胺合成酶(GS)及其抑制剂膦丝菌素GS的生理功能及酶学特征。
谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase(GS)，催化无机氮向有机氮的转化反应，植物体中的GS是将氨固定到有机物当中。膦丝菌素（PPT）的抑制机理是竞争性的与谷氨酰胺合成酶结合，抑制无机氮向有机氮的转化。从链霉菌中克隆编码使膦丝菌素乙酰化而失活的酶的基因Bar基因,连接CaMV启动子，并将其转化到土豆。Bar基因能合成乙酰转移酶，解除非选择性除草剂PPT对植物谷氨酰胺酶的抑制，避免植物细胞因为氨的积累而死亡。目前已将这个基因导入小麦、烟草、马铃薯、甜菜等作物，其中转基因马铃薯已进行大田试验并取得良好效果。