因此，现在一般的科研人员通常采用将 DNA 片段两端的数个碱基进行 S 化修饰，这样既能取得保护 DNA 的效果，又能增加 Antisense DNA 和目的模板的结合能力。
即使如此，现在还是有很多科研人员采用了全部 S 化的修饰方法，并且能得到非常良好的实验结果。因此，任何一项科研工作都不是绝对的，应根据具体情况设计实验方案。
21. Biotin标记有三种，它们之间有何不同？
ss-Biotin可提供比较长的连接臂（臂长约24.3A），有利于Biotin与Avidin间的结合，而且分子中含有S-S键，可使用还原剂（50 mM DTT或100 mM 巯基乙醇）方便地将探针分子（不再带有Biotin基团）与靶序列分开。Imino-Biotin可提供较短的连接臂（约13.5A），其最大特点是Biotin与Avidin的分离可在较温和的条件下进行：8M盐酸胍（pH4.0）。普通的Biotin提供与ss-Biotin相似长度的连接臂，但只能用8M盐酸胍（pH1.5）分离Biotin与Avidin.
22. FITC、6-FAM、5-FAM标记之间有何区别？
他们都是荧光素标记（Fluorescein），三者结构间的区别如下：
从结构图可见，5-FAM与6-FAM互为异构体：而FITC则在与oligo的连接方式上（硫脲键）有别于前者（酰胺键），但它们的发色团均为荧光素，通常使用中没有区别。
23. 淬灭基团为TAMRA或ECLIPSE的双标记荧光探针在使用上有什么不同?
由淬灭基团TAMRA或ECLIPSE组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针（Hydrolysis Probes），或称“TaqMan”探针，用于Real-time PCR实验。由于TAMRA与ECLIPSE光谱学性质不同（见下图），作为淬灭基团使用时的特点也不同，现说明如下： 加图1、2
◆ TAMRA为荧光染料，在淬灭报告基团的同时，自身会在更高波长处发射荧光，此发荧光会对报告基团的检测造成影响，探针荧光本底相对较高。而ECLIPSE为非荧光染料，淬灭报告基团，但自身不发射荧光，因此，探针荧光本底低，信噪比更大，检测灵敏度更高。
◆ 淬灭基团对报告基团的淬灭有赖于二者的光谱交盖（Overlapping），也即报告基团的荧光波长应落在淬灭基团的吸收光谱波长范围内。对比TAMRA与ECLIPSE的吸收光谱可见，TAMRA的吸收光谱波长范围窄，与之可匹配的报告基团种类比较少，而ECLIPSE具有更宽的吸收波长范围（390nm-625nm），可淬灭的报告基团种类很多（FAM、HEX、TAMRA、ROX等均可），用于多重PCR （Multiplexing PCR）时可有多种选择，因此淬灭基团为ECLIPSE的双标记荧光探针更适合于多重PCR。
24. TaqMan 探针设计时应遵循哪些原则？ ◆探针应位于两引物之间；
◆探针中碱基G、C的含量应在20%～80%之间； ◆避免同种碱基成串出现，特别是碱基“G”； ◆碱基G不要出现在5′末端；
◆探针的Tm值要比引物的Tm值高8-10℃，应在68-70℃之间；
◆探针长度超过30个碱基时，最好把淬灭基团放在中间，以防止荧光本底过高，这时探针的3′末端应加磷酸基封阻，以防探针延伸。