从小鼠尾巴中抽提基因组DNA
一、试剂与材料
⑴ 裂解液：50mM Tris(pH8.0) 100mM EDTA 0.5% SDS ⑵ 蛋白酶K(Proteinase K)
10mg/ml (溶解在pH8.0,50mM Tris和1mM CaCl2中，-20℃保存)。使用时，
终浓度达到100ug/ml
⑶ RNaseA
RNaseA溶液配制
将RNaseA溶解在0.001mol／l醋酸钠（pH5.2）中，使终浓度为10mg／ml，加热到 100℃，15min。室温下缓慢冷却，用0.1体积的1M的Tris-Cl调整pH至7.4后，小管分装保存在-20℃。使用时，终浓度为100ug/ml.
⑷ Tris平衡苯酚； 氯仿（三氯甲烷）；
Tris平衡苯酚:氯仿=1:1(体积比) 3M 醋酸钠（pH5.2）； 无水乙醇； 70%乙醇； 无菌ddH2O.
⑸ 手术剪，1.5mlEP管. 二、方法
⑴ 剪取0.5cm小鼠尾巴(约20-30mg)，立即放入细胞冻存管并投入液氮中（防止基因组DNA降解）。
⑵ 从液氮中取出鼠尾，剪碎，放入1.5mlEP管中，加入350ul裂解液、20ul
蛋白酶K和0.9ul RNaseA，混匀。
⑶ 在热孵育器中，55℃过夜。（刚开始可每隔30min摇晃一次）
后续操作可在冰上进行---
⑷ 取出EP管，加入等体积Tris平衡苯酚，用力摇晃3min；12000g，离心
10分钟。
⑸ 轻轻吸取上清至一新的1.5mlEP管中（宁可少吸，也不要吸到下层的苯
酚或沉淀物）。
⑹ 向上清中加入等体积苯酚/氯仿，用力摇晃2分钟；12000g，离心2分钟。 ⑺ 吸取上清至另一新的1.5mlEP管中，加入1/10体积的醋酸钠溶液和2.5
倍体积的无水乙醇，摇匀。
⑻ 12000g，离心1分钟，尽可能吸除上层乙醇。
⑼ 加入1ml，70%乙醇漂洗DNA，用力摇匀。（此步为了去除残留的SDS和苯
酚）
⑽ 12000g，离心1分钟，去除乙醇，再重复⑼、⑽一次（为了尽可能把DNA
清洗干净）。
⑾ 将EP管倒置在吸水纸上，以吸干乙醇。
⑿ 用65℃预热的无菌ddH2O,35ul溶解DNA，-20℃保存。 ⒀ 分光光度计检测纯度、浓度。
DNA提取的注意事项
1、裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进DNA溶解。
2、酚一定要碱平衡。苯酚具有高度腐蚀性，飞溅到皮肤、粘膜和眼睛会造成损伤，因
此应注意防护。氯仿易燃、易爆、易挥发，具有神经毒作用，操作时应注意防护。
3、各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。 4、取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。
5、异丙醇,乙醇.NaAc,KAc等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。
6、提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。 7、所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。
8、用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。
9、要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性DNA的降解。
10、避免剧烈吸打DNA，不能搅动基因组DNA。
11、吸取基因组DNA时，要用专用的粗口吸头，普通吸头可能会切断DNA或造成DNA缺口。
12、基因组应4度保存，如-20度保存可能导致DNA断裂。 13、在准备实验的过程中，应将DNA样品放在碎冰上。 14、用Tris缓冲液溶解DNA。
15、加缓冲液后，为了加速DNA溶解，可以轻轻晃动或轻弹试管。 16、加入缓冲液后，置于4度过夜，也可以溶解DNA 17、将DNA溶液65度温育10分钟，可以灭活DNase。
18、在抽提过程中如果水相和有机层的界面不太清楚，说明其中蛋白质含量较高，可增加酚/氯仿抽提的次数或适当延长离心的时间。
19、酚抽提时如果上清液太粘稠，无法进行水相转移时，可加入适量TES稀释后再抽提。
基因组DNA提取方法
制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等
试验步骤：
1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。
2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀。 4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,
5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相
6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.。
7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。 2500rpm,离心10min。弃上清。
8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。 9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。
外周血DNA提取技术
分离外周血白细胞提取方法： 试验步骤：
1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。 2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。 4、2500rpm离心10min，弃上清。 5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。 6、3000rpm离心10min，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，－80?C冻存。 试验要求：
血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。
氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA： 试验试剂： Ligsisbuffer：
133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。
ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。
提取缓冲液（Extractionbuffer）：
10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌
试验步骤：
1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。
2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。 3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。
4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。 5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。 6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。
7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。
9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。
10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。