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第一章 绪论
1.1研究目的和意义
自古以来，人类对生物发光深感兴趣而又迷糊不解。有百十中生物小至细菌大至鲨鱼，会在交配、进食、或逃避危险时发光。而新近的研究指出，生物的光在某些方面可能造福于人类。通过生物发光理论的研究了解生物发光的种类，机理及其在医学、生物科学、食品、环保等领域的应用。研究生物发光能够更深入了解到生物发光在实际的应用。生物发光的生物学意义主要是有助于猎食者捕食其他生物、被捕捉动物逃避捕者以及同种属动物的不同个体间信息的交换。例如，在发出求偶信息方面，在生殖季节，动物通过发光招引配偶，达到两性聚合，利于传种繁衍后代。萤火虫的发光是典型的求偶信号，并且是一个复杂的信号系统。生物发光技术已在生物医学、农产品等领域中发挥重要作用。在应用方面，如军事上观察海洋动物发光的突然爆发，可以判别水下军事设施及其他各种敌对目的物。生化分析中，利用虫荧光素与虫荧光酶加在一起遇到ATP就会发出荧光，而且发光强度正比于ATP浓度的现象，可以检测样品中ATP的含量。利用光蛋白与Ca反应极其灵敏的特性，可以测出小于10^-13摩尔的Ca含量。因而这种方法用在Ca超微量分析中。 生物发光现象还启发人类从工程角度研究、模拟这种发光效率极高而产热量极少的荧光现象，新一代冷光源的研制就是一例。相信，随着研究的进一步深入，它将在理论研究和实际应用中产生更大的价值。
1.2生物发光理论的研究现状
生物发光作为一种非放射性、非创伤损害性、高灵敏性、实时动态的检测技术，在医学生物学研究、食品及环境检测等领域应用广泛，随着科技的发展，在生物发光原理的研究越来越深[1]。目前，研究生物发光理论基本上从生物发光的种类，机理和应用三方面进行研究，早期的研究是从萤火虫发光这一现象开始研究，到后来深入到发光细胞的研究，实际上，很多生物发光反应就是在细胞或生物或生物体内的化学发光反应。在这些反应中，光能的产生方式主要有两种：一种是别激发后产生的光能信号，另一种是发生化学反应或生物学反应后产生的光能信号，从宏观到微观，使得生物发光理论越来越完善。特别由于对绿色荧光蛋白的深入研究，美国科学家马丁·查尔菲，以及美国华裔科学家钱永键获得2008年诺贝尔奖[2]
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1.2.1生物发光的定义
生物发光是指生物体发光器在细胞或生物体内发生光能释放反应的过程[3]。生物发光是属于化学发光范畴内，他是由于生物自身发光细胞构成的发光器而发光，目前应用最为广泛的是荧光素酶反应而产生的荧光。荧光素酶是生物体内产生的一种生物反应蛋白质，主要见于萤火虫、水母和一些细菌。
1.2.2生物发光的分类
生物发光的分类有几种分类方法，目前主要的分类有根据发光机理可以分为四类：受激荧光，发光生物发光，化学发光，生物的超微弱发光[4] 。
1. 受激荧光
受激荧光是指生物体在受到外界光辐射的作用时，体内固有的荧光物质或吸收的荧光标记物发光的现象。
2. 发光生物发光以萤火虫的闪光为代表。 3.化学发光
化学发光是在化学反应过程中(主要为氧化还原反应)发出可见光的现象。化学发光反应是由两个关键步骤组成：激发和发射。许多化学反应进行时能释放足够的自由能而把参加反应的物质之一激发到能发射光的电子激发态，生成一种激发态产物，在它回到基态时，剩余能量转变成光子能量生发光现象。
4.生物超微弱发光
超微弱发光可以分为二类：1、自发发光：（生物的化学发光）1）代谢化学发光 2）细胞分裂发光2、诱导发光1）延迟发光 2）电离辐射发光 3）电子作用的化学发光 4）声致发光 5）热发光
随着生物发光研究的进一步深入，发现人体的器官、组织、细胞、乃至大分子都在发光，不过发光强度更弱。目前研究已涉及到细胞、亚细胞乃至生物大分子的层次。越来越多的实验表明，DNA 是生物超微弱发光的一个辐射源[5]。
生物发光分为两类：①发生化学或生物学反应后产生的光能信号，主要有含荧光素酶的细菌、真菌、昆虫等；②被激发后产生的光能信号，主要有含荧光蛋白的水母、珊瑚、水螅等。
生物发光可分为:被动发光：如植物，那些微弱的红光是没能参与光合作用多余的光，一般的看法是这种光无意义。主动发光：如萤火虫的闪光。另外，有些动物本身并不会发光，但在共生的环境中它们会利用发光细菌的光为自己服务。
动物的发光器有两类，一类具有发光细胞，另一类具有共生的发光细菌。发光细胞是起源于皮肤而发生了变异和特化的腺细胞，能分泌荧光素和荧光素酶。
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如果发光细胞内同时含有荧光素和荧光素酶，则发光可在细胞内进行，此称细胞内发光；如果发光细胞内仅含有荧光素或荧光素酶，则发光必须在分别含有荧光素和荧光素酶的不同发光细胞之分泌物相遇时才能产生，此称细胞外发光。
1.2.3生物发光的原理和机制
生物发光是属于化学发光范畴之内,它是由于生物自身发光细胞构成的发光
器而发光。目前应用最为广泛的是荧光素酶反应而产生的荧光。荧光素酶是生物体内产生的一种生物反应蛋白质,主要见于萤火虫、水母( jelly2fish) 和一些细菌。荧光素酶（Lu?ciferase）以荧光素（Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O为底物，在Mg2＋存在时，底物在催化循环中会形成还原型核黄素磷酸盐和醛化合物，当遇到荧光素酶和氧时，形成一种激发的络合物。络合物断裂时生成氧化核黄素磷酸盐、酸、水及一个光子，化学能转变为光能[6]。
荧光素+ ATP+ O2→核黄素磷酸盐+醛化合物 核黄素磷酸盐+醛化合物→激发的络合物 激发的络合物→氧化核黄素磷酸盐+酸+水+光子 化学能→光能
ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源。在荧光素酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系。
荧光素的产生实质上是受荧光蛋白基因的控制的，在这种基因的转录和翻下指导合成的荧光蛋白实质上就是荧光素酶了.荧光素酶（英文名称：Luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyrali'的萤火虫体内的荧光素酶[7]。在相应化学反应中，荧光的产生是来自于萤光素的氧化，有些情况下反应体系中也包括三磷酸腺苷（ATP）。没有荧光素酶的情况下，萤光素与氧气反应的速率非常慢，而钙离子的存在常常可以进一步加速反应（与肌肉收缩的情况相似）。荧光素或荧光素酶不是特定的分子，而是对于所有能够产生荧光的底物和其对应的酶的统称，虽然它们各不相同。不同的能够控制发光的生物体用不同的荧光素酶来催化不同的发光反应。最为人所知的发光生物是萤火虫，而其所采用不同的荧光素酶与其他发光生物如荧光菇（发光类脐菇，Omphalotus oleariu'）或许多海洋生物都不相同。在萤火虫中，发光反应所需的氧气是从被称为腹部气管（abdominal trachea）的管道中输入。一些生物，如叩头虫，含有多种不同的荧光素酶，能够催化同一荧光素底物，而发出不同颜色的荧光。萤火虫有2000多种，而叩甲总科（包括萤火虫、叩头虫和相关昆虫）则有更多，因此它们的荧光素酶对于分子系统学研究很有用。目前
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研究得最透彻的荧光素酶是来自Photinini族萤火虫中的北美萤火虫[8].
2.1生物发光的基础理论知识 2.1.1 发光的生物和生物学意义
除人们熟知的萤火虫外, 原生动物、腔肠动物、软体动物、节肢动物、被囊动物和鱼类等, 都有发光种类存在, 约有一个40~50生物类群。在这些发光生物中, 陆生种类见于萤火虫、百足虫、千足虫、蛆绷和蜗虫等少数无脊椎动物。有些植物和真菌也能发光, 如发光树、发光草和发光花能发光的陆生脊椎动物缺乏报道, 但据说有些雕鹊和猫头鹰因羽毛粘有发光真菌而能发光。在非洲基尔森林里, 有一种杏黄色的萤鸟, 其头部和翅膀生有羽毛, 其余部分都是光溜溜的硬壳, 但布满了一层发光细胞, 当地人把这。种小鸟养在笼子里夜里当作灯笼照明淡水生的生物发光种类也为数极少, 绝大多数的发光等生物包括细菌、无脊椎动物和鱼类均属海产。由于海洋生物发光及其普遍，所以沿海渔民常将海水发光称为海火。乳状海火，火花状海火，闪光海火[9]。
发光对于动物的主要意义包括求偶、觅食、防御、进攻等，有人认为细菌发光可能也属于一种自身保护机制，目的在于消耗细胞内过多的氧化性物质。近年来，发现许多物种发光强度、波长和闪烁频率的变化具有其特定的含义，说明生物发光也许是生物个体间相互交换信息的一种手段。同时，观测该发光现象的变化将给我们提供许多关于物种迁徙繁殖，生态环境及气候变迁，乃至海洋潮汐及地球化学变化等信息，因此国外许多学者投入力量开展了部分海域生物发光现象的宏观观测和调查，提出了影响其变化的有关因素，并建立了相关的数学模型。近年来，随着越来越多的发光蛋白被提纯、其编码基因序列被测定、表达，人们开始研究不同发光物种发光蛋白之间，以及发光蛋白与同类非发光物种同源蛋白基因序列之间的同源性等，以探讨其系统发生及进化过程。例如，有人认为虫荧光素酶（Luciferase）是从AMP/CoA连接酶进化而来；而最近的证据表明，虫荧光素酶（Luciferase）同时具有脂肪酰辅酶A（Fatty Acyl-CoA）合成酶活性，其基因也与果蝇中编码脂肪酰辅酶A合成酶的序列（CG6178）高度同源[10]，提示虫荧光素酶可能是脂肪酰辅酶A合成酶的进化产物。目前越来越多的发光蛋白被提纯、其编码基因被克隆表达；同时其底物也被人工合成，因此其相关的基础研究和产品的商业化进展迅速。
已经发现的发光蛋白（Photoprotein）及其结构、活性部位、催化机理如下：细菌荧光素酶（Luciferase，LUX）：由两个对称的杂合二聚体构成，底物为FMNH2和醛。（2）虫荧光素酶（LUC）：活性位点在两个结构域（Domain）之间，底物为虫荧光素（Luciferin）及ATP，并需要Mg2+参与。（3）腰鞭毛虫（Dinoflagellate）荧光素酶：含有三个结构域，每个都具有发光活性，底物为腰鞭毛虫荧光素，同
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时需要O2参与；比较有特点的是：该荧光素在中性pH条件下与一种特定的荧光素结合蛋白（LBP）结合并被持续氧化，当pH下降时荧光素与结合蛋白解离并与上述荧光素酶结合，因此改变p H 可调控其发光强度变化。（4 ）水母素（Aequorin）及奥贝林（Obelin）：含腔肠素（Coelenterazine）过氧化物生色团，因此只需要Ca2+激活。（5）绿色荧光蛋白（GFP）[11]：来自水母，以共价结合自催化方式形成发色团，通过接受其它分子提供的能量产生荧光，其机理被称为生物发光共振能量转移（Bioluminescence ResonanceEnergy Transfer，BRET），类似的荧光蛋白还有橙色荧光蛋白（O F P ）、黄色荧光蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（RFP）、蓝绿荧光蛋白（CFP）等。另外，目前已经被发现的生物发光底物有：虫荧光素、腔肠素、FMNH2、腰鞭毛虫荧光素、种虾素（Vargulin）等。对于发光底物可产生不同波长的生物发光这个问题，目前公认的机理包括：（1 ）酶- 底物作用方式的变化，实验证明，发光蛋白活性位点单个或几个氨基酸的变化往往导致发射光谱的改变。（2）基于共振的电荷去定位化（Resonance-basedChargeDelocalization），光子分层传（Photonrelay）。（3）生物发光共振能量转移（BRET）生物发光的调控机制包括：神经系统传导，受体、神经递质、第二信使等[12]。最近有人发现在某些海洋发光鱼类的发光器官中存在一氧化氮合成酶样免疫活性物（NOS-IR），提示NO可能在生物发光调控机制中具有重要作用。利用基因工程技术，目前已经成功地表达出可产生各种波长生物发光和荧光的重组蛋白；同时也合成了可以产生不同波长生物发光的底物，甚至合成了一些可同时用于生物发光和化学发光的荧光素苯硼酸衍生物，并将特定的虫荧光素类似物用于光动力学治疗。
2.1.2 发光的方式
在生物本身因具有发光细胞或由发光细胞构成的发光器而发光。发光细胞是起源于皮肤而发生了变异和特化的腺细胞, 能分泌荧光素和荧光素酶。如果发光细胞内同时含有荧光素和荧光素酶, 则发光可在细胞内进行, 此称细胞内发光如果发光细胞内仅含有荧光素或荧光素酶, 则发光必须在分别含有荧光素和荧光素酶的不同发光细胞之分泌物相遇时才能产生, 此称细胞外发光。细胞内发光的生物类群有细菌、单细胞动物、低等无脊椎动物、萤火虫和某些鱼类细胞外发光的生物类群有水母、介形类、高等无脊椎动物和某些鱼类。某些蛆蜘受到刺激后, 能从背孔排出一种淡黄色粘液, 与空气接触后才能发光（一生种黄绿色光）。有
有些发光生物不但具有发光细胞，有的还有由发光细胞、色素层、反光层和晶状体构成的发光器, 其结构正好与光感受器眼睛相反。某些樱虾、磷虾、头足类和鱼类等发光类群都有相当复杂的发光器。发光器的数目和排列方式在同种动物中恒生不变, 所以发光器在动物分类学上具有重要意义。鱼类的发光器多分布于头部和上下领, 尤为眼睛的下方和贴后方, 以及身体两侧和腹面, 身体背面没有发光器, 这反映鱼类只对身体前面和下面的区域发光照明。
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