质粒DNA的转化、提取及酶切分析
摘要：目的 构建人Bcl-2基因原核表达载体，并对其酶切鉴定。方法 将Bcl-2重组质粒转化进入经CaCl2法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选培养充分克隆，然后用碱裂解法分离提取重组质粒DNA，最后用限制性内切酶酶切重组质粒DNA，并跑电泳鉴定。结果 Bcl-2重组质粒成功转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞，成功扩增提取到重组质粒DNA，酶切鉴定出现目的条带，但电泳结果较差，条带差。总结 实验过程中要避免杂菌的污染，重组质粒DNA的提取回收非常重要，如果回收浓度过低，最后跑电泳条带会很差，或者不出现目的条带。
关键词：人Bcl-2基因；质粒转化；CaCl2法；质粒提取；碱裂解法；酶切分析
随着现代分子生物学发展，分子生物学实验技术已经渗透到了生命科学的各个领域中。DNA重组技术是现代分子生物学最基本的操作技术，而质粒是存在于细菌染色体以外的小型环状双链DNA，能自我复制和表达其携带的遗传信息，所以质粒是DNA重组技术中的一种理想载体。进行DNA重组，经常要进行一些细菌转化、细胞转染、PCR扩增、酶切分析和DNA重组等试验，这就需要获得大量纯化的质粒DNA分子。本研究介绍人Bcl-2重组质粒DNA的转化、分离提取和内切酶酶切鉴定。转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状。转化效率直接影响前后试验的进展和工作效率，而感受态细胞的状态是影响转化效率最直接、关键的因素之一。感受态细胞的制备使用CaCl2法，因为CaCl2法转化效率高，简便易行常用。扩增后Bcl-2重组质粒DNA的分离提取使用碱裂解法，因为碱裂解法效果良好，回收效率高且经济[1]。分离获得的重组质粒DNA经限制性内切酶EcoR I酶切，并经琼脂糖凝胶电泳检测，看是否与预计相符合。
1. 材料与方法
1.1 试剂：不含氨苄青霉素的LB液体培养基、含氨苄青霉素的LB液体培养基、100mg/ml氨苄氨基酸溶液、人Bcl-2重组质粒、大肠杆菌DH5α、75%乙醇；碱裂解法试剂溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，氯仿、异丙醇、蒸馏水；限制性内切酶EcoR1及其缓冲液、1×TAE电泳缓冲液、SYBR Green荧光染料、DNA Maker。
1.2 仪器和器材：加样枪、枪尖、EP管、玻璃涂布器、恒温水浴箱、超净工作台、恒温摇床、恒温培养箱、电泳装臵、紫外成像仪。
1.3 方法：CaCl2法、碱裂解法、DNA限制性内切酶酶切分析法。 实验中将人Bcl-2重组质粒转化DH5α扩增菌，转化后在含Amp的培养基上进行筛选，生长的菌落即是含重组质粒的工程菌。扩增重组质粒工程菌获得的质粒作为限制性核酸内切酶的酶切底物DNA，酶切完跑电泳分析。
2. 实验操作 2.1 质粒转化
2.1.1 制备新鲜感受态DH5α大肠杆菌（实验前已经制备好）。 2.1.2 DNA重组子的转化大肠杆菌DH5α，如表1操作：
表1：DNA重组子的转化大肠杆菌DH5α
无菌条件下分别加入： 实验组 阴性对照组 新鲜感受态DH5a细菌 50ul 50ul 人Bcl-2重组质粒2ng/μl 5ul — 灭菌水 — 5ul ①轻轻旋转以混合内容物，冰浴30min，42摄氏度恰恰放臵90s，立即冰浴2min 1.加入不含氨苄青霉素的200ul 200ul LB液体培养基 ②摇床中37摄氏度、150r/min振摇15min，使细菌复苏并表达抗性基因。 ③每管取200μl加至含氨苄青霉素的LB琼脂平板上（平板侧面用标记笔做好标记），用玻璃涂布器涂布均匀，室温放臵，使液体吸收，用封口胶封好，然后37摄氏度培养12~16h至单菌落形成。
2.2 质粒DNA分离提取
2.2.1 用接种针调琼脂平板中单菌落于盛有2ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)的试管中，37℃摇荡培养过夜。
2.2.2 取菌液1ml收集在1.5ml的EP管中，10000r/min离心2min，吸弃上清，将离心管倒臵于一纸巾上，以使所有液体流出。
2.2.3 在沉淀中加入溶液Ⅰ 250μl，涡旋混匀，静臵5min。
2.2.4 加入新鲜配臵的溶液Ⅱ 250μl，颠倒5次，溶液变透明、粘稠。 2.2.5 加入溶液Ⅲ 350μl，颠倒混匀，溶液出现白色沉淀。 2.2.6 12000r/min离心2min，将上清转移至吸附柱中。 2.2.7 10000r/min离心30s，弃滤液。
2.2.8 向吸附柱中加洗脱液500μl，10000r/min 离心30s，弃滤液。 2.2.9 将吸附柱换到另一新EP管中，在吸附柱中央加buffer缓冲液20μl，10000r/min离心1min，弃吸附柱，得质粒DNA分离液。
2.3 DNA限制性内切酶酶切分析
2.3.1 在质粒DNA分离提取液中依次加入下列试剂：灭菌的双蒸水11μl，缓冲液2μl，20U/μl EcoR I 2μl，质粒DNA样品5μl，加至200μl EP管中，反应总体积20μl，加盖，混匀后稍离心，37摄氏度水浴反应1h。
2.3.2 配臵琼脂糖凝胶，并灌胶。
2.3.3 加样：取6×载样缓冲液5μl加入经酶切后的EP样品管中，轻轻混匀， 用微量移液器取15μl样品加到凝胶点样空中，每排孔需加一份DNA Make做对照。
2.3.4 接通电泳槽电源，跑电泳。 2.3.5 跑胶完毕，在紫外成像仪观察结果。
3. 实验结果 3.1 质粒转化结果
实验组培养基上生长有大量单个白菌斑（如图1所示），阴性对照组培养基上没有菌落生长(如图2所示)，阴性对照组培养基所加感受态细菌是不含人Bcl-2重组质粒的，表明感受态细菌本身没有含抗Amp基因，其在加Amp的平板上不能生长，感受态细菌也未被杂菌污染，而实验组中人Bcl-2重组质粒成功转化DH5α。
3.2 质粒DNA提取和酶切结果
重组质粒DNA提取产物的酶切电泳结果显示(如图4所示)，电泳图中1号加样孔出现两条条带，条带1为pBS(2.96kb)条带，条带2为目的Bcl-2(1.9kb)条带，条带2比较模糊，条带1相对清晰。
图1 实验组 图2 阴性对照组
图3 图4 电泳图谱
4. 讨论分析
4.1 质粒转化结果分析
4.1.1 实验组与对照组不同在于实验组加入了人Bcl-2重组质粒，人Bcl-2重组质粒中带有抗Amp基因，故实验组中人Bcl-2重组质粒转化DH5α工程菌能在含Amp的培养基上生长，而对照组加入的为无重组质粒的新鲜感受态DH5α细菌，
细菌不能存活。实验组与对照组对比表明人Bcl-2重组质粒转化成功，为下一步操作打下坚实基础！
4.1.2 实验组菌落生长分布比较均匀，说明涂平板时也图得比较均匀；菌落大小均一，生长状况也一致，未发现杂菌菌落，结合对照组中无菌落生长，表明感受态细菌未被杂菌污染，操作过程中也没有被杂菌污染。实验组菌落生长比较密集，说明平板涂布不太好，加入的菌液过多。菌落较密集的话，在挑选菌落培养时不易操作，不易挑到单个菌落。比较理想的菌落生长情况是生长分布均匀又不密集(如图3所示)，但图3中平板涂布不好，涂平板时把胶弄破了(图3中箭头所示)，涂平板时应小心轻盈。
4.1.3 在实验过程中要注意生物安全，尤其在质粒转化实验中要严格无菌操作，避免杂菌污染。
4.1.4 电穿孔技术与CaCl2法相比，电穿孔技术的转化速度快，转化效率也更高[2],但电穿孔技术需要特殊仪器，成本较高。CaCl2法操作方便，比较常用。在本实验中，从菌落生长比较密集来看，CaCl2法的转化效率已经很好的满足了要求。
4.2 质粒DNA提取和酶切结果
4.2.1 从大肠杆菌细胞中分离提取质粒DNA对接下来的酶切非常重要，提取到的质粒DNA量太少或质量太差都可能在酶切后跑不出条带。碱裂解法提取质粒DNA中，使细菌溶解破坏的主要是NaOH，NaOH同时使细菌中染色体和蛋白质变性，所以，加入溶液Ⅱ这一步比较关键，加入溶液Ⅱ的时间不能过长(不能加完试剂去接电话等)，也不能剧烈震荡，强碱环境中时间不能过长，基因组DNA会慢慢断裂，剧烈震荡也会使基因组DNA断裂。
4.2.2 pBS-Bcl-2重组质粒分子量为4.86kb，其中质粒载体pBS为2.96kb，人Bcl-2 cDNA为1.9kb，酶切电泳可能的结果有4.86kb、2.96kb、1.9kb三条带。结果酶切电泳出现两条条带，2.96kb条带(条带1)和1.9kb条带(条带2)，条带2比较模糊，Maker的条带也没有跑分开，有拖带现象，原因可能是电泳的电压过高，导致Maker跑得过快未能较好分开。条带的亮度主要与DNA的含量有关，DNA的含量越高，条带越亮越粗。质粒DNA的含量和酶切的时间都会影响到酶切的效果，质粒DNA的含量过少，可能最后跑电泳看不到条带；酶切时间过短可能导致酶
切不完全，看不到理想的条带。本实验中，如果是酶切不完全，应该会看到三条带，或者只出现4.86kb带，但本实验出现两条带，说明酶切比较完全。条带模糊的原因可能是分离提取到的质粒DNA底物浓度过低，提取的质粒DNA没有经过核酸检测仪测定浓度，只是取5μl质粒DNA底物用于酶切，5μl的质粒DNA底物含量可能过少，远远没有达到2μg。
参考文献：
1. 张泉.朱鸿飞.于可响.薛方明.孙怀昌.ZHANG Quan.ZHU Hong-fei.YU Ke-xiang.XUE Fang-ming.SUN Huai-chang重组大肠杆菌碱裂解方法的改进[期刊论文]-中国生物工程杂志2007,27(2)
2.刘卫今，蒋勇，完迪迪.简单高效的感受态细胞制备和质粒转化体系的建立.安徽农业科学.Journal dAnhui Aoi．Sei．2008,36(7)：2745—2746