细胞凋亡-tunel法

产品组分 编号 组分 产品编号/规格 40307ES20（20T） 40307ES50（50T） 40307ES60（100T） 40307-A 40307-B 40307-C 40307-D 40307-E 40307-F 操作步骤 1. 细胞爬片的准备 在Lab-Tek载波片小室（Chamber Slides）上培养贴壁细胞。在凋亡诱导处理之后，用PBS洗2遍载玻片。 2、标记与检测 1）按1:5的比例用去离子水稀释适量5×Equilibration Buffer（每个样品需要100μl 1×Equilibration Buffer）。 2）每个样本滴加100μl 1×Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育10-30min。或者将载玻片放入一个含有1×Equilibration Buffer的缸中，保证缓冲液没过样本。在平衡细胞的同时在冰上解冻Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix，并依照表1，准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液。对于面积小于5cm的一个标准反应，其体积是50μl，用50μl乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需TdT孵育缓冲液的总体积。对于表面积更大的样本，可成比例的增大试剂体积。 表1准备用于实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液 组分 ddH2O 5×Equilibration Buffer Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix Recombinant TdT Enzyme 体积（μl/50μl体系） 34 10 5 1 225×Equilibration Buffer 750μl 1.25 ml×2 250 μl 50 μl 100 μl 12μl 250μl 1.25 ml×3 250 μl×2 50 μl×2 100 μl×2 25μl 500μl Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix 100 μl Recombinant TdT Enzyme Proteinase K(2 mg/ml) DNase I (1 U/μl) 10 × DNase I Buffer with MgCl2 20 μl 40 μl 5μl 100 μl 3）在平衡后的区域周围用吸水纸洗掉100μl 1×Equilibration Buffer中的大部分，然后在5cm面积的细胞上加入50μl TdT孵育缓冲液。不要让细胞干掉。这之后的操作，载玻片要避光。 4）把塑料盖玻片盖在细胞上以保证试剂的平均分布，在湿盒的底部放上用水浸湿的纸巾。将载玻片置于湿盒内，在37℃孵育60min。将湿盒用铝箔纸包裹以避光。 5）移除塑料盖玻片，并将切片置于PBS溶液中室温孵育5min，换用新鲜PBS再重复清洗2次。 6）用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的PBS溶液。 7）样本在染色缸中染色，在黑暗中将载玻片浸入装有DAPI溶液（2μg/ml，用PBS新鲜配制并稀释）的染色缸，室温放置10 min。 8）洗涤样本，将载玻片浸入PBS水中，室温放置5分钟。洗涤一次。 9）叩干载玻片上多余的水并向样本区域加100μl PBS保持样本湿润。 10）立即在荧光显微镜下分析样本，用标准的荧光过滤装置在520±20nm的荧光下观察绿色荧光；在＞620nm下观察PI的红色荧光，或在460nm观察蓝色的DAPI。如有必要，载玻片能在4℃黑暗条件下存放过夜。【注】：PI/DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞都染成红色/蓝色，只在凋亡的细胞核中才有Alexa Fluor 488-12-dUTP掺入而定位的绿色荧光。