中国组织工程研究 第20卷 第43期 2016–10–21出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research October 21, 2016 Vol.20, No.43
www.CRTER.org
·研究原著·
生物活性玻璃陶瓷涂层与Hedgehog信号通路调控成骨 倪卫东，方龙云 (延边大学医学院，吉林省延吉市 133002；延边大学附属延边医院骨科，吉林省延吉市 133002)
引用本文：倪卫东，方龙云. 生物活性玻璃陶瓷涂层与Hedgehog信号通路调控成骨[J].中国组织工程研究，2016，20(43): 1
21
2
6424-6430.
DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.43.006 ORCID: 0000-0003-0077-4594(倪卫东)
文章快速阅读： 生物活性玻璃陶瓷涂层调控成骨过程中的Hh信号通路变化 大鼠骨髓间充质干细RT-PCR 制备一块10 mm×4 mm×4 mm胞提取及培养 观察生物活的生物活性玻璃陶瓷涂层，应用Western blot 性玻璃陶瓷 扫描电镜及透射电镜观察 免疫荧光染色 涂层对成骨 检测骨形态发生蛋白的影响 2和Gli1的表达 细胞划痕实验 文题释义：
生物活性玻璃陶瓷：是指经热处理之后从无定形的生物玻璃中析出的微晶相而形成的陶瓷，其结构介于玻璃及陶瓷之间，具有优良的生物活性和成骨诱导性。
Hedgehog信号通路：Hedgehog基因是一种分节极性基因，因突变的果蝇胚胎呈多毛团状，酷似受惊刺猬而得名。哺乳动物中存在3个Hedgehog的同源基因：SonicHedgehog、Indian Hedgehog和Desert Hedgehog。Hedgehog(Hh)蛋白家族成员均由2个结构域组成：氨基端结构域及羧基端结构域，其中氨基端结构域有Hh蛋白的信号活性，而羧基端结构域则具有自身蛋白水解酶活性及胆固醇转移酶功能。Hh信号传递受靶细胞膜上2种受体Patched和Smoothened的控制。目前发现的参与Hh信号转导的核内因子包括转录因子Ci/Gli、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Fused、Fu抑制剂、类运动蛋白 Costal-2、蛋白激酶A等。其中Ci/Gli、Fu起正调控作用，Cos 2、PKA起负调控作用。
摘要
背景：生物活性玻璃陶瓷作为钛合金涂层的应用，已在临床上获得成功。而Hedgehog(Hh)信号通路与成骨关系密切，但目前为止还没有生物活性玻璃陶瓷涂层与Hh信号通路调控成骨过程的关系的研究。 目的：探讨生物活性玻璃陶瓷涂层与Hh信号通路调控成骨过程的关系。
方法：①制备生物活性玻璃陶瓷涂层材料，应用扫描及透射电子显微镜观察涂层结构；②将原代培养大鼠骨髓间充质干细胞接种在生物活性玻璃陶瓷涂层上，应用荧光定量RT-PCR、Western blot、免疫荧光染色等方法检测成骨标志物骨形态发生蛋白2和Hh信号通路关键因子Gli1(Gliloma-association oncogene homoglog)的表达，并观察细胞的迁移能力。
结果与结论：①电镜下生物活性玻璃陶瓷涂层表面无裂纹，表面光滑，具有致密的介孔结构,涂层厚度约350 nm；②生物活性玻璃陶瓷组中骨形态发生蛋白2和Gli1 mRNA和蛋白表达水平显著高于对照组，且Gli1和骨形态发生蛋白2蛋白在成骨过程中相互联系；与对照组相比，生物活性玻璃陶瓷组的骨髓间充质干细胞的迁移能力明显增强。③结果提示生物活性玻璃陶瓷涂层通过增加Hh信号通路的转录因子Gli1的表达，进而促进激活Hh信号通路，增强Hh信号通路活性，协同增加骨形态发生蛋白2，共同促进成骨细胞的生长增殖。 关键词：
生物材料；骨生物材料；生物活性玻璃陶瓷；涂层；骨髓间充质干细胞；Hedgehog信号通路；Gli1；骨形态发生蛋白2；成骨细胞；国家自然科学基金
主题词：
骨髓；间质干细胞；成骨细胞；组织工程
基金资助：
国家自然科学基金项目(81260279)
6424
P.O. Box 10002, Shenyang 倪卫东，男，1988年生，江西省赣州市人，汉族，延边大学在读硕士，主要从事干细胞与肿瘤方面的研究。
通讯作者：方龙云，博士，副主任医师，硕士生导师，延边大学附属延边医院骨科，吉林省延吉市 133002
中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2016)43-06424-07 稿件接受：
2016-09-08
www.CRTER.org
110180
倪卫东，等. 生物活性玻璃陶瓷涂层与Hedgehog信号通路调控成骨
Ni Wei-dong, Studying for master’s degree, Yanbian University College of Medicine, Yanji 133002, Jilin Province, China
Corresponding author: Fang Long-yun, M.D., Associate chief physician, Master’s supervisor, Department of Orthopaedics, Affiliated Yanbian Hospital of Yanbian University, Yanji 133002, Jilin Province, China
www.CRTER.org
Correlation of bioactive glass ceramic coating and Hedgehog signaling pathway in osteogenesis
Ni Wei-dong1, Fang Long-yun2 (1Yanbian University College of Medicine, Yanji 133002, Jilin Province, China; 2Department of Orthopaedics, Affiliated Yanbian Hospital of Yanbian University, Yanji 133002, Jilin Province, China)
Abstract
BACKGROUND: Bioactive glass ceramics (BGC) has been successfully applied as titanium alloy coating in the clinic. However, the correlation between Hedgehog signaling pathway and BGC coating in osteogenesis has not yet been reported.
OBJECTIVE: To explore the correlation of Hedgehog signaling pathways and BGC coating in osteogenesis.
METHODS: The BGC coating was prepared and observed by scanning and transmission electron
microscopes. Primary cultured rat bone marrow mesenchymal stem cells were incubated onto the BGC coating. The expressions of bone morphogenetic protein 2 and Gliloma-association oncogene homoglog in the Hedgehog signaling pathway were detected using fluorescent quantitative RT-PCR, western blot assay, and immunofluorescence staining, and the cell migration ability was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Electron microscopes showed that there were no cracks on the smooth BGC coating that had the dense mesoporous structure, and the coating thickness was 350 nm. The mRNA and protein expressions of bone morphogenetic protein 2 and Gliloma-association oncogene homoglog in the BGC group were significantly higher than those in the control group; and the expresssed bone
morphogenetic protein 2 and Gliloma-association oncogene homoglog proteins interacted with each other in the process of osteogenesis. The cell migration ability in the BGC group was obviously enhanced
compared with the control group. These results indicate that the BGC coating increases the expression of Gliloma-association oncogene homoglog, then further activates the Hedgehog signaling pathway, and finally accelerates the osteoblast proliferation in combination with bone morphogenetic protein 2. Subject headings: Bone Marrow; Mesenchymal Stem Cells; Osteoblasts; Tissue Engineering Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 81260279
Cite this article: Ni WD, Fang LY. Correlation of bioactive glass ceramic coating and Hedgehog signaling pathway in osteogenesis. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(43):6424-6430.
[10-11]
0 引言 Introduction
目前在骨科临床上需要解决因创伤、感染、肿瘤、畸形等因素所致的骨缺损越来越常见，成为骨科临床面临的一大难题。目前临床上对骨缺损进行修复重建应用的植骨材料除自体骨和同种异体骨之外，还有生物活性陶瓷、高分子聚合物、组织工程骨等。
生物活性玻璃陶瓷属于表面生物活性陶瓷材料，其结构介于玻璃及陶瓷之间，集合了二者的优点，能通过一定的生物化学反应与骨组织或软组织进行结合，逐渐转变成天然骨，是目前骨移植替代材料研究和开发新型骨植入体材料的热点。有研究表明结合钛合金的优良力学性能和生物活性玻璃陶瓷的生物活性的优势，是制备高性能、高可靠性生物植入材料的有效途径成功
[7-9]
[4-6]
[3]
[2]
[1]
具有重要调控作用。Hh信号通路和多种生长因子，
如转化生长因子β、骨形态发生蛋白、Sox9(SRY-related high mobility group box 9)等，相互作用调节成骨及软骨细胞生长，并且可调节间充质细胞向成骨细胞方向分化
[12-13]
。
但目前为止还没有研究生物活性玻璃陶瓷涂层与成骨过程中Hh信号通路调控关系的相关文献报道。
实验以骨髓间充质干细胞在生物活性玻璃陶瓷涂层成骨分化时起调控作用的Hh信号通路关键分子Gli1(Gliloma-association oncogene homoglog)为研究的切入点，探讨生物活性玻璃陶瓷涂层与Hh信号通路调控成骨过程关系研究，为生物活性玻璃陶瓷作为钛合金涂层的临床应用，提供有力的理论依据。
。生物
活性玻璃陶瓷作为钛合金涂层的应用，已在临床上获得
。
Hedgehog(Hh)信号通路与成骨关系密切，不但在调控骨组织发育过程中起重要作用，也可以促进成骨相关细胞的分化，对脊椎动物骨骼系统的形成和发育
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 细胞学体外实验。
1.2 时间及地点 实验于2015年11月至2016年3月在延边大学医学院再生医学研究所完成。
6425
倪卫东，等. 生物活性玻璃陶瓷涂层与Hedgehog信号通路调控成骨 1.3 材料 实验动物：雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠1只，
鼠龄8周，体质量约180 g，由延边大学动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(吉)2011-0007，实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。
主要材料：生物活性玻璃陶瓷涂层由延边大学工学
院所制备提供。将圆形盖玻片经NaOH溶液、去离子水、乙醇清洗，烘干备用。取P123、Ca(NO3)2?4H2O、正硅酸乙酯、磷酸三乙酯、0.5 mol/L盐酸1.0 g、乙醇60 g按一定比例混合均匀室温搅拌(实际温度20-22 ℃)24 h。将处理好的盖玻片浸入混合液，3 000 r/min离心1 min，烘干，马弗炉500 ℃煅烧，制成10 mm×4 mm×4 mm的生物活性玻璃陶瓷涂层。
主要试剂及仪器：Alpha MEM培养基购自韩国
Welgene公司；胰蛋白酶、胶原酶、鼠Gli1单克隆抗体购自美国Sigma公司；BCA蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技公司；兔GAPDH单克隆抗体、兔骨形态发生蛋白2多克隆抗体购自英国Abcam公司；兔β-actin多克隆抗体购自北京博奥森生物技术公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；Alexa 555 羊抗兔和Alexa 488羊抗鼠荧光二抗、CO2恒温细胞培养箱购自美国Thermo公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔、山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术公司；HT7700型透射电子显微镜和TM3030型扫描电子显微镜购自日本日立公司；紫外分光光度计购自德国Eppendorf公司；倒置显微镜购自日本Olympus公司；电泳槽、电转仪、荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；酶标仪购自德国BMG公司；激光共聚焦显微镜购自德国Leica公司。 1.4 方法
1.4.1 生物活性玻璃陶瓷涂层的形态及结构的观察 用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察制备好的生物活性玻璃陶瓷涂层是否有裂纹及其表面的致密度、介孔结构、涂层厚度及孔穴的情况。
1.4.2 骨髓间充质干细胞的获取、培养与鉴定 大鼠麻醉处死，在无菌条件下截取双侧股骨及胫骨，从骨髓腔中抽取骨髓，离心除去脂肪和组织液，收集较为纯净的骨髓细胞悬液。用Percoll对其进行梯度离心制备单个核细胞。调整细胞浓度到2×109
L-1
，将细胞平均分为2组：生物活性玻璃陶瓷组和对照组。
其中生物活性玻璃陶瓷组加入一块10 mm× 4 mm×4 mm的生物活性玻璃陶瓷涂层，对照组单纯接
6426
www.
CRTER.org
种细胞。然后将培养板放入37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养。于培养48 h后第1次换液，通过贴壁培养法，每次换液弃除悬浮的杂质细胞，以后2 d换液1次。
取培养的第4代细胞进行下列实验。传代至第4代时细胞形态均一，主要为梭形成纤维细胞样形态，从而达到了骨髓间充质干细胞的有效分离和纯化。通过荧光定量RT-PCR、Western blot法和免疫荧光染色法检测分离细胞的成骨标志物骨形态发生蛋白2的表达，确定为成骨细胞
[14]
。
1.4.3 荧光定量RT-PCR 收集生物活性玻璃陶瓷组和对照组细胞，按照Trizol总RNA抽提纯化试剂盒说明书操作，提取细胞的总RNA，紫外分光光度仪检测纯度和浓度，按反转录试剂盒说明书合成cDNA，按Invitrogen一步法试剂盒说明书操作进行荧光定量RT-PCR检测骨形态发生蛋白2和Gli1 mRNA的相对表达水平。
反应体系用GAPDH作内参。扩增条件：95 ℃ 预变性 30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环后65 ℃ 延伸5 s，PCR产物根据Ct值进行相对定量分析。荧光定量RT-PCR引物序列：Gli1上游引物：5'-CTG GAC CTG CAG ACG GTT ATC-3'，下游引物：5'-AGC CTC CTG GAG ATG TGC AT-3'；骨形态发生蛋白2上游引物：5'-CCT CCG TGG GGA TA-3'，下游引物：5'-CAC TGT GCG CAG CT-3'；GAPDH上游引物：5'-AGA TCA TCA GCA ATG CCT CCT GC-3'，下游引物：5'-ATG GCA TGG ACT GTG GTC ATG AG-3'。
1.4.4 Western blot分析 分别收集生物活性玻璃陶瓷组和对照组中对数生长期的细胞，用蛋白裂解液提取细胞总蛋白，按BCA蛋白定量试剂盒说明进行，测细胞蛋白提取液的蛋白浓度。取等量的蛋白混合上样缓冲液加入上样孔中，用80 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，分离的蛋白电转移至PVDF膜后，用体积分数5%
脱脂奶的TBST室温封闭1 h，TBST洗膜3×5 min，加入骨形态发生蛋白2(1∶1 000)、Gli1(1∶1 000)抗体，4 ℃孵育过夜；TBST洗膜3×5 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(抗兔或抗鼠)孵育1h，TBST洗膜3×5 min，加入化学发光法曝光显影，冲洗胶片，用紫外分光光度计扫描条带灰度值，β-actin作为内参照，进行灰度分析。 1.4.5 免疫荧光染色 细胞接种于放置生物活性玻璃陶瓷涂层膜和空白对照膜的6孔板培养，培养至细胞60%-80%融合时，取细胞爬片涂层膜用PBS漂洗。标本经 40 g/L中性多聚甲醛固定，血清封闭，加入一抗骨
形态发生蛋白2(1∶100)与Gli1(1∶100)4 ℃过夜。PBS
P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org
倪卫东，等. 生物活性玻璃陶瓷涂层与Hedgehog信号通路调控成骨
漂洗，分别加入Alexa 555羊抗兔或Alexa 488羊抗鼠二抗，37 ℃避光30 min，PBS漂洗，DAPI染色后用甘油封固，在激光共聚焦显微镜下扫描，计算机数据采集，数字成像。
1.4.6 细胞划痕实验 将生物活性玻璃陶瓷组和对照组细胞分别接种于6孔培养板中，待细胞铺满后用灭菌黄色枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线做划痕，枪头要垂直。用PBS冲洗3次，加入低血清培养基，继续培养。划线后12，24，48 h时进行观察。
1.5 主要观察指标 骨形态发生蛋白2和Gli1的表达水平。
1.6 统计学分析 应用SPSS 16.0分析系统进行分析，数据以x_
±s表示，组间比较采用单因素方差分析(F 检验和q检验)。计数资料采用卡方检验进行比较。P < 0.05为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 生物活性玻璃陶瓷涂层的形态及结构 扫描电镜下可见生物活性玻璃陶瓷涂层表面无裂纹，光滑致密(图1A)。透射电镜下，生物活性玻璃陶瓷涂层的表面粗糙，呈颗粒状，具有致密的介孔结构，交织成蜂窝状，呈多孔结构(图1B)；涂层厚度约350 nm(图1C)。
2.2 骨髓间充质干细胞的形态特点 原代培养约24 h后，骨髓间充质干细胞开始贴壁，48 h后贴壁细胞明显增多并开始分裂增殖，4 d左右细胞可达到80%的融合，细胞为梭形、多角形或不规则形，呈集落状生长。传代后，细胞多为梭形，胞体较原代略膨大，三四天即可达到100%融合。再次传代后，细胞变为形态更均一的梭形，呈漩涡状或放射状排列(图2)。
2.3 骨形态发生蛋白2和Gli1 mRNA和蛋白的表达水平 荧光定量RT-PCR检测结果见图3，在生物活性玻璃陶瓷组中骨形态发生蛋白2和Gli1 mRNA相对表达水平显著高于对照组(P < 0.05)。
Western blot检测结果显示，与对照组相比，生物活性玻璃陶瓷组中骨形态发生蛋白2和Gli1蛋白表达水平明显增加(P < 0.05；图4)。
激光共聚焦显微镜下显示，生物活性玻璃陶瓷组骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白2和Gli1蛋白均呈高表达；免疫荧光骨形态发生蛋白2阳性表达呈现红色荧光，主要定位于细胞浆；Gli1阳性表达呈现绿色荧光，主要为核表达；Gli1和骨形态发生蛋白2 蛋白在细胞内同一位置重叠的部分呈现黄色荧光，说明Gli1与骨形态
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH
www.CRTER.org
发生蛋白2在骨髓间充质干细胞成骨过程中相互联系(图5)。
2.4 骨髓间充质干细胞的迁移 与对照组相比，12 h时生物活性玻璃陶瓷组骨髓间充质干细胞的迁移能力无明显变化，24和48 h时迁移能力明显增强(图6)。
3 讨论 Discussion
生物活性玻璃陶瓷材料在骨科临床上是一种很有应用前景的生物材料，其具有良好的生物相容性、生物活性和骨诱导作用，为成骨细胞提供与机体内相似的生长微环境，保证和促进成骨细胞的生长增殖
[15-17]
。这与
此次实验结果相一致，实验发现生物活性玻璃陶瓷涂层具有良好的生物相容性、生物活性和成骨诱导作用，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的生长增殖分化。作者进一步探讨了生物活性玻璃陶瓷涂层与Hh信号通路调控成骨过程关系的研究。
研究表明Hh信号途径介导了间充质干细胞向成骨、软骨细胞转化和软骨骨化的一系列过程，多种因素可直接或间接的通过调控Hh信号途径从而使间充质干细胞向成骨细胞分化
[18]
。Gli1是Hh信号通路中重要的转录因
子，可激活Hh信号通路，并且是检测该通路激活的重要标志，核内Gli1蛋白水平与Gli1转录活性成正比，核蛋白Gli1的表达水平反应Hh信号通路的活性
[19-22]
。通过荧
光定量RT-PCR及Western blot检测结果提示生物活性玻璃陶瓷涂层可增加Hh信号通路的转录因子Gli1的表达，进而促进激活 Hh 信号通路，增强Hh信号通路活性，诱导一系列下游信号分子的释放，从而发挥调控骨髓间充质干细胞的成骨过程。
Hh诱导成骨细胞的分化需要功能性的骨形态发生蛋白信号，Hh和骨形态发生蛋白通路协调作用促进成骨细胞的分化
[23]
。Hh信号中介Gli1可直接激活骨形态发生
蛋白信号，这也证实Hh通路与骨形态发生蛋白通路在调节软骨形成中相互联系
[24-25]
。
从免疫荧光实验结果可以看到，Gli1和骨形态发生蛋白2在生物活性玻璃陶瓷涂层中高表达，在调节骨髓间充质干细胞定向分化为成骨细胞过程中相互联系。骨形态发生蛋白2是骨形态发生蛋白家族中重要的骨形成调节因子，具有最强的异位成骨能力，能够使未分化的间充质干细胞定向分化为成骨细胞，并诱导形成骨组 织
[26-28]
。有研究报道骨形态发生蛋白2基因转染的骨髓
间充质干细胞与生物活性玻璃陶瓷复合培养具有良好的生物相容性，其分泌人骨形成蛋白2的水平较多
[29]
。
6427
倪卫东，等. 生物活性玻璃陶瓷涂层与Hedgehog信号通路调控成骨 www.CRTER.org
mRNA相对表达水平(2??) Ct-图1 生物活性玻璃陶瓷涂层形态
Figure 1 Morphology of the bioactive glass ceramic coating
图注：图中A为扫描电镜下生物活性玻璃陶瓷涂层；B为透射电镜下涂层介孔结构；C为透射电镜下介孔涂层切面形态。
图2 骨髓间充质干细胞形态(×100)
Figure 2 Morphology of bone marrow mesenchymal stem cells (×100)
图注：培养48 h后，细胞为梭形，呈漩涡状或放射状排列。
DAPI Gli1 4 对照组 生物活性玻璃陶瓷组 a 骨形态发生蛋白2 合并 3 a 2 1 图5 培养于生物活性玻璃陶瓷涂层的骨髓干细胞中骨形态发生
0 骨形态发生蛋白2 Gli1
蛋白2与Gli1蛋白的定位(免疫荧光化学染色，×800) Figure 5 Location of bone morphogenetic protein 2 and Gliloma-association oncogene homoglog in bone marrow mesenchymal stem cells cultured onto the bioactive glass ceramic coating (immunofluorescent staining, x800)
图注：Gli1阳性表达呈现绿色荧光，主要为核表达；骨形态发生蛋白2阳性表达呈现红色荧光，主要定位于细胞浆；Gli1和骨形态发生蛋白2 蛋白在细胞内同一位置重叠的部分呈现黄色荧光；在激光共聚焦显微镜下观察到，生物活性玻璃陶瓷组的骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白2与Gli1蛋白均呈高表达。
图3 培养于生物活性玻璃陶瓷涂层中的骨髓间充质干细胞中骨形态发生蛋白2与Gli1的mRNA的表达变化
Figure 3 mRNA expressions of bone morphogenetic protein 2
and Gliloma-association oncogene homoglog in bone marrow
mesenchymal stem cells cultured onto the bioactive glass ceramic coating
a 图注：与对照组相比，P < 0.05。
蛋白相对表达水平(β-actin的灰度比值) 0.75 对照组 生物活性玻璃陶瓷组 生物活性玻璃陶瓷组 对照组
a
β-actin
骨形态发生蛋白2
Gli1
0.50 a 0.25 0
骨形态发生蛋白2 Gli1
图4 培养于生物活性玻璃陶瓷涂层的骨髓干细胞中骨形态发生蛋白2与Gli1蛋白的表达变化
Figure 4 The protein expressions of bone morphogenetic protein 2 and Gliloma-association oncogene homoglog in bone marrow mesenchymal stem cells cultured onto the bioactive glass ceramic coating 图注：与对照组相比，aP < 0.05。
6428
P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org