分类号： 学号：
四川农业大学硕士学位毕业论文
开题报告
畜禽废水污染胁迫下芦苇和大薸在分
子水平上的变异研究
硕士研究生 ： 指导老师：
专 业 ：环境工程
研究方向：
农
业大学
二年三月
目录
一、 选题背景?????????????????????? 1 1.1、环境生物技术的诞生????????????????? 1 1.2、外来动植物引进后对环境的影响???????????? 1 1.3、对植物受污染胁迫研究的深入????????????? 1 1.4、川农污水处理厂的生物处理方法???????????? 2 二、 文献综述?????????????????????? 2 2.1分子标记技术的产生和种类??????????????? 2 2.2常用分子标记技术简介????????????????? 5 2.3 RAPD分子标记技术及其应用领域???????????? 8 2.4植物受环境污染胁迫国内外研究进展?????????? 11 2.5大薸、芦苇污染胁迫研究进展??????????????16 三、 目的意义??????????????????????18 四、 研究内容??????????????????????18 五、 技术路线??????????????????????19 六、 材料方法??????????????????????19 七、 预期结果??????????????????????22 八、 进度安排??????????????????????22 九、 经费预算??????????????????????22 十、 参考文献??????????????????????23
一、 选题背景
背景1:环境生物技术的诞生
随着人类的进步、社会的发展和科学技术水平的提高，环境污染问题也随之凸显出来，并且日趋严重，具有复杂性、多样性和综合性的特点。人们对环境保护、污染治理提出了新的要求，不但要集中治理工厂、生活区产生的污染，还要治理由于生产和事故等原因造成的地下水、海洋和土壤的污染，而高效、快捷和经济地消除污染的方法就是利用生物处理技术或生物修复技术。
生物处理技术如果从19世纪末英国使用生物滤池处理生活污水算起，已经有一个多世纪了。在这一个多世纪中，生物处理技术有了很大的发展，从生物滤池法到活性污泥法、厌氧消化法、流化床法、各种方法层出不穷，处理的废水也从生活污水扩大到工业有害有毒废水甚至重金属废水，还可用于处理固体有机废物和废气等。
生物修复技术起源于有机污染物的治理，最初的生物修复是从微生物的利用开始。人类利用微生物制作发酵食品已有几千年的历史，利用好氧或厌氧微生物处理污水已有100多年的历史，但是利用生物修复技术处理现场有机物才有30年的历史。首次记录实际使用生物修复是在1972年，于美国宾夕法尼亚州的Ambler清除管线泄漏的汽油。最初，生物修复的应用范围仅限于试验阶段，直到1989年美国阿拉斯加海域受到大面积石油污染以后，才首次大规模应用生物修复技术。
生物处理技术和生物修复技术在环境治理和环境保护中的广泛应用，衍生出一门新的学科和新的技术，即环境生物技术[1~10]。 背景2：外来动植物引进后对环境的影响
人们为了达到对污染物降解处理和生态恢复的目的，大量引进和培养具有较强去污能力的动物、植物和微生物，甚至不惜花巨资研究具有多种污染物高效去除能力的超级生物。生物技术在环境治理和环境保护上的应用虽然具有成本低、效率高的优点，但是我们在环境中应用生物技术（生物处理技术和生物修复技术）的时候，还应该注意防止给环境带来新的不必要的生物污染。现在流行的利用构建的超级基因工程菌的方法来处理受污染土壤和污染水体，由于构建的超级细菌具有较强对多种污染物的降解和去除能力，在使用时应该特别注意防止其作为外源物种进入环境，由于构建的基因工程菌比环境中原有的土著菌具有更强的适应性和生活力，如果其作为外来物种侵入环境，无疑将凭借其快速的物质利用性和广谱的底物利用范围成为优势种群，将会使环境中的土著菌消失，破坏当地的生态环境[2]。
再如，水葫芦和大薸对有机废水都有较强的去除能力，在同类浮水植物中具有明显的优势，如果合理利用于环境污染治理，及时清理受污染水体中大量繁殖的多余个体，将造福于人类，但是，如果利用不当，仍其自由疯长，将会使水质进一步恶化，如同超级细菌一样遏制土著水生动植物的生长。
因此，我们在进行环境生物治理时，应当合理利用，特别注意防止外来生物的引进对环境带来破坏。
背景3：对植物受污染胁迫研究的深入
随着人口增长，人们在努力发展经济，提高生产力的同时，环境污染问题日益突出，而环境污染问题反过来又制约着经济的发展。而最佳的环境治理方法就是利用植物来进行，如何培育耐高浓度废水、废气以及土壤污染物并且具有较高污染物去除率的植物是人们关注的一个话题。大多数农作物在受环境污染后产量明显降低，人们对培育耐污染农作物提高农作物产量也是人们特别关注的一个话题。
当前，全球性的环境污染日益加剧，在一定程度上改变了自然地理环境，使植物种群长期受到不同浓度的环境污染胁迫，植物受污染胁迫最显著效应就是消除敏感种或个体，改变生物群落物种构成，对自然界的物种进行重新洗牌。环境污染的区域性是大量污染敏感种灭绝的主要原因, 是物种多样性和遗传多样性丧失的重要原因之一；然而，有些植物对污染胁迫环境具有相当大的适应潜力，这种潜力表现在外部形态上有的明显，有的却不够明显。例如，有些植物在受污染胁迫环境下能正常生长，甚至表现出比未受污染时更强的生活力。为此，人们花大量的精力和物力进行植物抗污染胁迫机理的研究，而研究得较为深入的是从植物的生理生化指标来进行，从分子水平上进行的还比较少，可以预见，今后人们的工作重点将从分子水平上来进一步揭示植物抗性机理[11~22]。 背景4：川农污水处理厂的生物处理方法
四川农业大学污水处理厂，位于四川农业大学教学科研实习园，主要处理四川农业大学畜禽养殖场中每天大量排放的畜禽废水，其人工湿地中栽种有大量对有机废水去除效率较佳的芦苇，污水处理的最后一个环节是依靠生长在生物氧化塘中的大薸来完成的，以进一步去除经上一个畜禽废水生物处理环节人工湿地中排放出来的废水的色度和有机氮、磷。由于合理利用、严格管理、及时收割人工湿地中的植物和清理生物氧化塘中的大薸，因此，他们对畜禽废水都有较佳的去除能力。经生物氧化塘最终处理过的畜禽废水完全能够达到国家《污水综合排放标准》（GB8978-1996）中第二类污染物最高允许排放浓度一级标准。处理后的废水直接排入濆江河支流，经长期监测下游水质状况，并没有富营养化现象发生。
基于人们对废水生物处理研究的关心、对外来动植物引进后对环境的影响的关注、对植物污染环境胁迫研究的深入以及研究材料取用方便等原因，因此，本文主要选用了人工湿地植物芦苇和大薸作为我的研究材料来进行研究。
二、文献综述
2.1 分子标记技术的产生和种类
为了对生物体基因组进行系统性研究，在遗传学上常构建遗传图谱，而遗传图谱的构建经历了不同的发展阶段，它随着标记方法的改进而逐渐发展改进，从低密度的基于形态性状遗传连锁图谱发展至基于染色体的细胞学标记以及以同功酶，等位酶为基础的生物化学标记（也称作蛋白质标记），以至于当今基于DNA分子标记的高密度遗传连锁图谱的建立[23]。
DNA 分子标记(DNA molecular markers)或称遗传标记(genetic markers) 本质上是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段。1980年Bostein等提出分子标记技术限制性片段长度多态性RFLP (Restriction fragment length polymorphism , RFL P), 为遗传图谱的构建战略和技术带来了革命性的变革。此后，随着PCR技术于1985年的问世和迅速崛起，PCR技术与电泳技术的结合，在短短的二十多年里, 特别是近十年中,DNA 分子标记技术的研究变得空前活跃, 相继有数十种名称各异的基于分子杂交技术或PCR 扩增技术而产生的分子标记技术问世，这一系列分子标记技术的问世将进一步推动高密度遗传图谱的发展和扩大其应用领域。推动DNA 分子标记技术研究迅速发展的动力,一方面是原有技术存在的缺点或应用上的限制, 另一方面就是DNA 分子标记技术的广泛应用及其取得的长足进步。DNA 分子标记技术已广泛应用于生物基因组研究, 生物的遗传育种、起源进化、分类、医学、环境诊断及法医破案等诸多方面, 是现代分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。
DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映。DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异。因此，DNA标记在数量上几乎是无限的。DNA分子标记无表型效应，可对不同发育阶段的个体、不同的组织、器官甚至细胞作检测，既不受环境的影响，也不受基因表达与否的限制，使对植株基因型的选择成为可能；基因组变异十分丰富，分子标记的数量远远超出表型性状标记的局限；大多数分子标记是共显性的，对隐性性状的选择成为可能。理想的DNA标记应具备以下特点：①遗传多态性高；②共显性遗传，信息完整；③在基因组中大量存在且分布均匀；④选择中性；⑤稳定性、重现性好；⑥信息量大，分析效率高；⑦检测手段简单快捷，易于实现自动化；⑧开发成本和使用成本低。虽然已发展出十