实验三 植物染色体畸变的观察
一、实验目的
1.了解人工诱导植物多倍体的原理、方法及其在植物育种上的意义； 2.鉴别诱导后染色体数目的变化；
3.学习和掌握对植物组织及细胞中鉴定DNA分布的孚尔根反应染色方法，以及对切片或染色体处理的压片方法，为今后的有关实验和科研工作准备条件。 二、实验原理
自然界各种生物的染色体数目一般是相当稳定的，这是物种的重要特征。例如黑麦体细胞染色体为14条，配成7对。遗传学上把一个配子的染色体数，称为染色体组，用n表示。如黑麦体染色体组内包含7对染色体，它的基数Ｘ=7。一个染色体组内每个染色体的形态和功能各不相同，但又相互协调，共同控制生物的生长、发育、遗传和变异。
由于各种生物的来源不同，细胞核内可能具有一个或一个以上的染色体组，凡是细胞核中含有一套完整染色体组的就叫做单倍体，亦用n表示。具有两套染色体组的生物体称为二倍体，以2n表示。细胞内多于两套染色体组的生物体则称为多倍体。如三倍体(3n)、四倍体(4n)、六倍体(6n)等，这类染色体数目的变化是以染色体组为单位的增减，所以称作整倍体。
按染色体组的来源，在整倍体中又可区分为同源多倍体和异源多倍体。凡增加的染色体组来自同一物种或者是原来的染色体组加倍的结果，称为同源多倍体。如果增加的染色体组来自不同的物种，则称为异源多倍体。
多倍体普遍存在于植物界，目前已知道被子植物中有1/3或更多的物种是多倍体，如小麦属染色体基数是7，属二倍体的有一粒小麦，四倍体的有二粒小麦，六倍体的有普通小麦。除了自然界存在的多倍体物种之外，又可采用高温、低温、Ｘ射线照射、嫁接和切断等物理方法人工诱发多倍体植物。在诱发多倍体的方法中，以应用化学药剂更为有效。如秋水仙素、萘嵌戊烷、异生长素、富民农等，都可诱发多倍体，其中以秋水仙素效果最好，使用最为广泛。
秋水仙素是由百合科植物秋种番红花－秋水仙的种子及器官中提炼出来的一种生物碱，化学分子式为C22H25NO6，具有麻醉作用，对植物种子、幼芽、花蕾、划分和嫩枝等可产生诱变作用。它的主要作用是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体不走向两极而被阻止在分裂中期，这样细胞不能继续分裂，从而产生如同数目加倍的核。若染色体加倍的细胞继续分裂，就形成多倍性组织。有多倍性须知分化产生的性细胞，所产生的配子是多倍性的，
因而也可通过有性繁殖方法把多倍体繁殖下去。
多倍体已成功地应用于植物育种，用人工方法诱导多倍体，可以得到一般二倍体所没有的优良经济性状，如粒长、穗长、抗病性强等。三倍体西瓜、三倍体甜菜、八倍体小黑麦已在生产上应用。在单倍体育种(如花粉培养、花药培养等)中，最终也需进行加倍才能获得具育性的品种，这也要用到多倍体诱导技术。
孚尔根染色法是鉴别细胞中DNA反应的组织化学方法。细胞内的DNA(通常位于核及染色体上)在1N HCl 60℃水解时部分地破坏了脱氧核糖与嘌呤碱之间的糖苷键而使嘌呤碱脱掉，从而使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的醛基获得了自由状态。而无色的亚硫酸品红是由偏重亚硫酸钠、盐酸和碱性品红配制成的。偏重亚硫酸钠与盐酸能产生亚硫酸根，当具有醌式结构的碱性品红分子与亚硫酸根结合后，醌式结构的共轭双键被打开，碱性品红变为无色。当用这种无色的亚硫酸品红去染经酸解的细胞时，就会与染色体DNA上游离的醛基结合，又出现了呈现红色的醌式结构，从而使DNA分子着色。这一反应是1924年由Feulgen 和Rossonbek 所发现和确定的，已广泛用作鉴别DNA的一种特异性检查方法。其优点是制片清洁，染色体清晰，组织软化好，易于压片，还可以对染色体DNA的含量进行测定。其缺点是，染色体较软，容易缠绕，不易分散，在加强前处理使染色体缩短的情况下，可获得较好的效果。另外，对小型染色体的材料效果较差。这一方法在切片、涂片上研究核及染色体时能减少细胞质着色对观察的影响。因此在细胞学研究中受到了普遍的重视。
水解是本实验成败的关键之一。温度应保持在60?0.5℃之间(用两支温度计相互校正)。如果温度过低或时间过短，酸解不够，醛基暴露不充分，染色会过浅；若温度过高或时间过长，会造成酸解过度，使DNA完全解聚，糖与醛基之间的键被破坏，流离的核酸分子会扩散到细胞质中，从而造成染色浅或不均一的现象。
水解的时间很重要，因为核酸的水解有两个过程。第一，嘌呤碱很快被除掉，脱氧核糖中潜在的醛基显露出来。第二，组蛋白和核酸越来越多地被除掉。在短时间的水解作用以后，第一个过程占优势，这时候用Schiff试剂染色，染色体的染色作用最强。随水解作用的继续进行，第二个过程逐渐变成优势，因此水解液中的Schiff反应增强，而染色体中的Schiff反应减弱。最后，第二个过程超过第一个过程时，染色体也随之停止反应。 RNA分子中也有嘌呤碱，那么经酸解后，用Schiff试剂染色时，为什么不能使RNA分子着色呢？这是由于在酸解的情况下，RNA分子较DNA分子稳定，它的醛基难以游离出来。所以，利用孚尔根法染色时，只能使DNA分子着色而不能使RNA分子着色。 影响孚尔根反应的主要因素有以下几个方面：
(1)水解时间和温度： 这是实验的主要关键。水解适当时，染色体着色较深而细胞质不显颜色，水解不足，染色体着色浅淡，细胞质中可能有其他醛基存在而显示扩散的红色。水解过度，则染色体着色不匀，这是由于DNA解聚而产生的游离核酸分子从染色体扩散到细胞质中，使细胞普遍着色。随着时间的过度，会使水解液中的反应增强，而细胞不能着色。
(2)固定液的成分： 不同成分的固定液常出现不同的颜色反应。含铬酸的固定液产生红色，酒精-醋酸固定液产生红色、紫红色，只用酒精的呈现紫色，用含甲醛的固定液则呈现强烈的紫红色。当需要对染色体中的DNA 定量测量时，一般只能用不含金属离子和甲醛的固定液，如酒精-醋酸固定液等。
(3)SO2含量： Schiff试剂中的SO2含量也影响孚尔根反应的颜色表现。SO2含量低时呈红色，含量高时则偏向蓝色。
(4)染色质中DNA的含量： 供试材料的染色质中DNA含量的不同是影响显色反应强度的根本因素。不同生物和不同的组织与细胞中DNA含量不同，显色强度也各异，并且二者之间是正相关的。由于上述因素和实践了解，具有大、中型染色体的材料，如百合科及部分禾本科植物材料，适于用孚尔根反应，小型染色体的材料特别如玉米、水稻等不适于用孚尔根法染色，它们的染色体用孚尔根法时着色是很浅的。 三、材料及用品
1. 材料
洋葱，刮去老根，放在小烧杯上，加水至刚与根部接触为止，室内培养至新根长出0.5～1.0cm左右。
2. 用具及药品
(1)用具
显微镜、烧杯、量筒、酒精灯、镊子、刀片、载片、盖片、小滴瓶、指管、吸水纸、铅笔。
(2)药品
0.01%～0.1%的秋水仙素水溶液、1mol/LHCL、无水乙醇、70%乙醇、45%醋酸、卡
诺氏固定液、希夫（Schiff）试剂等 四、实验步骤
实验内容：
1．用秋水仙素诱发植物产生多倍体；
2．通过取材、固定、解离、孚尔根染色法制片、镜检观察；
3．找出根尖细胞中期分裂相，确定诱发成功的细胞，观察加倍根尖细胞的染色体数目。 实验步骤： 1．多倍体诱导
当洋葱新根长至0.5～1.0cm左右时，将上述小烧杯中的水换成含0.1%秋水仙素水溶液，置阴暗处培养2d，至根尖膨大为止。
2．固定
11:30左右，用蒸馏水冲洗根尖2次，切取根尖末端0.5cm投入卡诺氏固定液(无水乙醇:冰醋酸=3:1)中，固定2～8h，95%乙醇冲洗一次，换入70%乙醇保存。
3．解离
固定好的材料用蒸馏水冲洗，在放入1N盐酸中60?C水浴10分钟（或用浓盐酸与无水乙醇等体积混合配制的解离液解离10分钟）。
也可采用酶解法，即用2%的纤维素酶（其中含有一定量的果胶酶），室温处理2~5小时（37?C处理0.5~1小时）。以根尖伸长区透明、分生区呈乳白色时停止解离为宜，水洗3次。
4. 染色
将解离过的材料用蒸馏水冲洗，去除材料中残留的酸，以便染色。吸净水分，加入希夫试剂，加盖染色10分钟（最好在黑暗条件下处理）。
5. 漂洗
染色后，细胞中残留着一些有色的品红分子，这会影响DNA的定性和定量分析。故染色后需先用蒸馏水冲洗，再用漂洗液冲洗三次，每次2~5分钟。注意每次加盖，漂洗后用蒸馏水冲洗2~3次，并保存于蒸馏水。
6. 压片
取根尖置于载玻片上，压碎，加一滴45%的乙酸，加盖玻片，覆以吸水纸，适当用力压片；必要时用铅笔硬头敲击压片，以利于分散。
7.观察
低倍镜下寻找染色体分散良好的分裂相，换高倍镜观察染色体数目。 五、实验报告
1. 染色体记数，区分染色体加倍和未加倍的细胞；绘出所观察到的多倍体细胞的染色体图。
2. 秋水仙素诱导多倍体的原理是什么?
3. 对照feulgen染色中用盐酸处理与否的镜检结果之异同。
4. 说出能够诱发多倍体的其他因素，想一想用这些因素应该怎么做这个实验? 5. 根尖经秋水仙素处理之后为什么会发生膨大? 六、注意事项
1.Schiff试剂及时取放，及时清洗吸Schiff试剂的吸管。 2.黑暗条件下染色。 附：Schiff试剂的配制方法
Schiff试剂：即脱色亚硫酸品红。溶解1g碱性品红于200ml 煮沸的重蒸馏水中，轻加摇动。继续煮5分钟使之完全溶解，冷却至50-55℃时过滤到棕色有塞子的试剂瓶中，加入1N HCl20ml，继续冷却至25℃，再加入1g偏亚硫酸钾(K2S2O5)或偏亚硫酸钠(Na2S2O3)。摇动使溶解，密
闭瓶口置黑暗低温处或冰箱内(4℃左右)18-24h后检查。试剂如透明无色或呈淡黄色时即可使用。如有不同程度的红色未褪，可加入0.5-1g活性炭，激烈震荡1分钟，仍在低温下静止1小时或过夜。然后用粗滤纸迅速过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在5℃以下冰箱内可以保存5-6个月。
植物染色体畸变的观察（之二）
一、实验目的
1．了解染色体结构变异的基本诱变原理和变异类型，观察植物根尖细胞染色体畸变的类型；
2．学习蚕豆根尖细胞微核制片与检测技术，了解微核测试技术在诱变作用检测上的应用。