实验报告
实验项目名称：基因工程综合实验 实验项目性质：综合性实验 所属课程名称：基因工程 班 级：11生物工程1班 学 号：秋叶 指 导 老 师 ：陈忠正
实验完成时间：2014
年5月11日
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目录：
0.摘要 ..................................................3
1.前言 ..................................................3
2.实验材料和仪器................................................3
2.1 实验材料
2.2实验仪器 .
3.实验试剂 ..........................................4
3.1 DNA提取所需试剂
3.2 PCR实验所需试剂
3.3 双酶切实验所需试剂
4.实验步骤 ...........................................4
4.1 质粒DNA提取
4.2 聚合酶链式反应（PCR）
4.3 质粒DNA的双酶切分析
4.4 琼脂糖凝胶制备
5.实验结果与分析 ...........................................7
5.1质粒DNA提取所得凝胶电泳结果
5.2 PCR扩增实验结果
5.3质粒DNA的双酶切分析结果
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摘要：实验包括质粒DNA的提取、DNA的凝胶电泳、质粒DNA中靶基因的酶切分析及质粒DNA中重组进的靶DNA序列的PCR扩增。通过本综合实验，帮助大家理解质粒DNA的提取原理、凝胶电泳中DNA分离的机理、限制性内切酶的工作原理及PCR是如何实现DNA扩增的，通过实验同时让同学掌握DNA的提取技术、凝胶电泳技术、DNA酶切分析技术及靶基因的体外快速扩增技术，了解实验中出现的现象并学会分析与解决实验中出现的有关问题。 聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。
关键词：凝胶电泳 限制线内切酶 DNA质粒
1 前言 本次实验对象为含有重组了1kb DNA片段的PET32.a表达质粒。该表达质粒中长度约6kb。首先采用离心破碎法破碎细胞，再使用碱裂解法提取质粒DNA。最后通过各种化学抽提纯化质粒DNA，最后得到纯化后的DNA质粒作为之后实验的材料。在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。
PCR(聚合酶链式反应）是根据DNA双螺旋结构在变性温度下解链为单链DNA，在退火温度下加入反应体系的特异引物根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，然后在延伸温度下，通过DNA聚合酶的聚合作用，不同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则，由引物引导合成出与模板DNA互补的新链，实现DNA的扩增的技术。 本次实验我们将以纯化后的质粒DNA作实验材料，在预先设计好引物后用PCR技术扩增目的片段。
在PCR实验的同时，我们将利用提取的质粒DNA作目的序列的双酶切实验。限制性内切酶能在适当温度、pH等条件下识别DNA序列中的特定序列并对识别序列进行有效切割。
利用琼脂糖凝胶电泳，我们可以通过电泳结果检验DNA提取纯度、PCR和双酶切实验的效果，并对比各组实验效果了解实验各步骤的各项影响因素核试验操作。
2 实验材料和仪器 2.1实验材料
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大肠杆菌DH5α（含重组了约1000bp DNA片断的PET32.a表达质粒，Amp抗性）
2.2 实验仪器
高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪、小三角瓶、PCR仪、微量移液器、冰盒、制胶模、电泳仪。
3 实验试剂
3.1 DNA提取所需试剂
3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖
溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)； 溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)，现配现用； 溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至5.2；
3.2 PCR实验所需试剂
实验一提取的质粒DNA，0.5U/μL的 Taq酶及5 × PCR buffer、1 mmol/L 的dNTP、克隆基因特异引物PF、PR（各1μmol/L），0.2mL的PCR管，TIP头，goldview DNA染色剂，琼脂糖，10×上样缓冲液，0.5×TBE、marker DNA等。 PCR扩增引物：
PF：5`—CTCGGATCCATGGAGCTAGCTACTGCGGG—3` PR：5`—CCGGTCGACTCCATCAATCTTGGAAAGCA—3` 3.3双酶切实验所需试剂
实验一提取的质粒DNA，BamHI（3 U /μL），HindⅢ（3 U /μL），1.5mL的EP管，TIP头，goldview DNA染色剂，琼脂糖，6×上样缓冲液，0.5×TBE等。
4 实验步骤 4.1 质粒DNA提取
4.1.1取1mL菌液放入Ep管中，12000 r/min（简写rpm）离心1min；弃尽上清；（注：先倒液体入废液缸，再倒扣用吸水纸吸干液体，残留液体可移液器吸干）
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4.1.2加入200μL预冷的含RNaseA的溶液I，旋涡以充分混匀；
4.1.3加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静置5min以充分裂解细菌； 4.1.4加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，－20℃放置8min（常温也可，但产量可能下降），12000rpm离心5min；吸上清至另一新的1.5mL EP管，加500μL氯仿/异戊醇（V：V=24：1）充分混匀，12000rpm离心5min；
4.1.5小心移取上清液500μL至另一新的1.5mL EP管，加入2倍体积无水乙醇，充分混匀，-20℃静置10min，12000 rpm离心10min，弃上清；（静置期间安排制备琼脂糖凝胶，每组制胶一块，具体见附件）加入200μL 70%乙醇洗DNA沉淀，12000rpm离心5min，倒掉乙醇，再12000rpm离心几秒钟，用移液器尽可能除去乙醇，烘箱适度风干；
4.1.6加入20μL RTE （含10μg/mL RNaseA 的TE，pH8.0）溶解质粒DNA， 37℃放置10min（时间充分可以考虑放置30分钟，以充分消化RNA）。
4.1.7取4～5μL质粒DNA溶液于另一干净离心管中，加入8μL TE及2μL上样缓冲液，混匀后全部点样于一个琼脂糖凝胶点样孔中。
4.1.8打开电源开关，调电压为80~100伏进行电泳 (注意电泳方向！！！)。 4.1.9电泳约40分钟后关掉电源，把凝胶置于紫外仪上观察结果并记录。
4.2 聚合酶链式反应（PCR）
4.2.1PCR反应液配制：反应体系为20μL （请先计算出如下各成分所需加入的量）
反应液组分
起始浓度 反应系终浓度 20μL反应体系所需量（请计算）
取2μL已稀释10×的质粒DNA溶液 2μL 2μL 2μL 10μL 2μL
DNA模板 引物PF 引物PR dNTP mix 反应buffer Taq酶
提取的质粒 5ng到10ng 10μmol/L 10μmol/L 2.5mmol/L 10× 0.5U/μL
0.2μmol/L 0.2μmol/L 0.25mmol/L 1×
20μL体系加1U
4.2.2把上述配制的反应液体系放置于PCR仪中，并使PCR仪运行如下PCR反应程序，实现靶DNA的扩增：
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