(5)温度对酸性蛋白酶菌株产酶的影响
温度是固态发酵一个重要的可调节参数，它是影响微生物生长和繁殖的重要条件之一，另一方面由于固态发酵传热性差，如果不能迅速将发酵热移出，将会使发酵温度急剧上升，导致温度失控，进而使发酵反应无法进行．为寻求合适的发酵温度，本项研究以酸性蛋白酶发酵培养基含水量为38% 、pH值为6．5的条件下培养84h，对27℃ 、30℃ 、33℃ 、37℃和40℃不同温度分别进行发酵培养，测定酶活力，证明酸性蛋白酶菌株产酶发酵最适温度为33℃，结果见图5。
37500酸性蛋白酶活力/(U.g-1)3500032500300002750025000273033温度/36C39。图5 温度对酸性蛋白酶菌株产酶的影响
（6）不同铵盐不同浓度对酸性蛋白酶菌株产酶的影响 铵盐作为重要的无机氮源对酸性蛋白酶菌株产酶的生产有很重要的作用，生产中常常加入一些铵盐来促进黑曲霉菌的产酶，本研究分别加入不同浓度的氯化铵、硫酸铵、碳酸氢铵进行发酵试验，发酵结果如图6。由图6可以看出少量的硫酸铵对产酶有促进作用，但随着浓度的增加产酶量有下降的趋势。氯化铵的浓度对产酶基本没影响。
碳酸氢铵随着浓度的增加对产酶有很大的阻遏作用。
40000酸性蛋白酶活力（U/mL）350003000025000200001500010000500000246铵盐浓度/%图6 不同铵盐对酸性蛋白酶产酶的影响硫酸铵氧化铵碳酸氢铵81012
（7）不同磷酸盐对酸性蛋白酶菌株产酶的影响
磷酸盐在酸性蛋白酶的生产很重要。在使用麸皮，米糠等有机磷含量丰富的原料时，添加一定的磷酸盐时会出现明显的促进效果。本研究对磷酸氢二铵、磷酸氢二钾进行实验。，通过改变无机磷的种类和含量，于33℃ 、初始pH值为6.5和含水量为38％条件下发酵，研究不同浓度磷酸盐对酸性蛋白酶菌株产酶的影响，结果见图7。添加磷酸盐有利于促进酸性蛋白酶菌株的产酶，且添加0．2% 的磷酸氢二钾对酸性蛋白酶菌株的产酶促进最大。
40000磷酸氢二钾磷酸氢二铵蛋白酶活力/（U.g-1）37500350003250030000275002500000.10.20.30.40.5磷酸盐的浓度图7 磷酸盐对酸性蛋白酶菌株产酶的影响
3、酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线
固体发酵采用基础培养基（麸皮：豆粕：玉米淀粉＝100:9:2）、含水量38%、初始pH值为6.5、添加0．2%的磷酸氢二钾和硫酸铵在33℃进行发酵培养，研究发酵进程曲线，结果如图8。由酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线可以看出，0～24 h发酵产酶速度较缓；24～60 h酸性蛋白酶产酶迅速增加，发酵时间达到72h后，进程曲线趋于平缓，84 h酶活力最高，其酸性蛋白酶活力（干基）达到36500 U／g，为了缩短发酵周期，发酵最适时间为72h。
3750035000325003000027500250002250020000175001500012500100007500500025000012243648发酵时间/h607284酸性蛋白酶活力/（U.g）-1图8 酸性蛋白酶菌株发酵进程曲线
五、酸性蛋白酶酶活力稳定性研究
黑曲霉产的酸性蛋白酶因其最佳反应pH 较低, 与畜禽体内消化系统基本一致, 用于饲料添加剂添加饲料中, 可以有效的弥补畜禽肠道内源蛋白酶分泌不足, 提高蛋白质消化率, 降低畜禽代谢性腹泻的发生。近年来, 随着饲料工业的快速发展, 酸性蛋白酶作为一种生物饲料添加剂表现出的潜能越来越被人们所关注。但酸性蛋白酶作
为饲料添加剂, 它不仅要经受饲料加工过程中的高温处理、动物胃肠道胃酸的影响, 而且还受饲料中部分金属离子的影响,而这些过程中酶活极易受损, 从而影响其作为饲料添加剂的效果。本项研究对黑曲霉菌株（Aspergillus niger ）所产酸性蛋白酶的稳定性进行了研究。
1、pH值对酸性蛋白酶稳定性的影响
酸性蛋白酶在一定pH 范围内酶活力比较稳定（如图9）。当反应环境pH为3.5, 酸性蛋白酶相对酶活力可以达到85%, 在pH为4.0 时, 相对酶活力最高达90%, 可以确定pH为4.0时是酸性蛋白酶最适反应pH值。pH值过高或过低明显影响酶活力,在pH 为5.0时, 相对酶活力只有65%, 在pH为2.5时, 相对酶活力也只有70%。
100酸性蛋白酶相对酶活力（%）80604022.533.5pH44.55图9 不同pH对酸性蛋白酶稳定性的影响
2、温度对酸性蛋白酶酶活力和稳定性的影响
酸性蛋白酶在不同反应温度下酶活力有很大差异（如图10）。一方面是当温度升高时, 酸性蛋白酶反应速率加快, 另一方面由于随着温度的升高使酸性蛋白酶逐渐变性而失去活性, 引起酶反应速率
下降。酸性蛋白酶适宜的反应温度为35～40℃, 在40℃相对酶活力表现出最高, 在低于30℃或者高于45℃时, 相对酶活力明显下降。因此认为40℃的反应温度是酸性蛋白酶最适宜的温度。
酸性蛋白酶相对酶活力（%）10090807060504020253035温度/（。C）404550图10 不同温度对酸性蛋白酶酶活力的影响
酶本身就是一种具有生物活性的蛋白质, 一定温度必然引起蛋白质的变性从而使酶失活,随着温度的升高变性的时间越快, 酶失活也就越迅速。如图11所示，酸性蛋白酶在70℃时, 随着时间的延长酶活力开始下降。固体酶在烘箱中70℃保温至5min 保留有90%的相对酶活力,当时间延长至10min时, 剩余酶活有80%，30min时，剩余酶活仍有19.8%，这提示固体酸性蛋白酶有着较好的抗高温性能。
100806040200051015时间（min）202530酸性蛋白酶相对酶活力（%）图11 70。C下酸性蛋白酶的存活曲线
3、不同金属离子对酸性蛋白酶稳定性的影响