GATK使用方法详解
一、使用GATK前须知事项：
（1）对GATK的测试主要使用的是人类全基因组和外显子组的测序数据，而且全部是基于illumina数据格式，目前还没有提供其他格式文件（如Ion Torrent）或者实验设计（RNA-Seq）的分析方法。
（2）GATK是一个应用于前沿科学研究的软件，不断在更新和修正，因此，在使用GATK进行变异检测时，最好是下载最新的版本，目前的版本是2.8.1（2014-02-25）。下载网站：http://www.broadinstitute.org/gatk/download。 （3）在GATK使用过程中（见下面图），有些步骤需要用到已知变异信息，对于这些已知变 异，GATK只提供了人类的已知变异信息，可以在GATK的FTP站点下载（GATK resource bundle）。如果要研究的不是人类基因组，需要自行构建已知变异，GATK提供了详细的构建方法。
（4）GATK在进行BQSR和VQSR的过程中会使用到R软件绘制一些图，因此，在运行 GATK之前最好先检查一下是否正确安装了R和所需要的包，所需要的包大概包括ggplot2、gplots、bitops、caTools、 colorspace、gdata、gsalib、reshape、RColorBrewer等。如果画图时出现错误，会提示需要安装的包的名称。 二、GATK的使用流程
GATK最佳使用方案：共3大步骤，即:
原始数据的处理 --> 变异检测 --> 初步分析。
原始数据的处理
1. 对原始下机fastq文件进行过滤和比对（mapping） 对于Illumina下机数据推荐使用bwa进行mapping。 Bwa比对步骤大致如下： （1）对参考基因组构建索引： 例子：bwa index -a bwtsw hg19.fa。
构建索引时需要注意的问题：bwa构建索引有两种算法，两种算法都是基于BWT的，这两种算法通过参数-a is 和-a bwtsw进行选择。其中-a bwtsw对于短的参考序列是不工作的，必须要大于等于10Mb；-a is是默认参数，这个参数不适用于大的参考序列，必须要小于等于2G。 （2）寻找输入reads文件的SA坐标。
对于pair end数据，每个reads文件单独做运算，single end数据就不用说了，只有一个文件。 pair end：
bwa aln hg19.fa read1.fq.gz -t 4 -I > read1.fq.gz.sai bwa aln hg19.fa read2.fq.gz -t 4 -I > read2.fq.gz.sai single end：
bwa aln hg19.fa read.fq.gz -l 30 -k 2 -t 4 -I > read.fq.gz.sai 主要参数说明：
-o int：允许出现的最大gap数。 -e int：每个gap允许的最大长度。
-d int：不允许在3’端出现大于多少bp的deletion。 -i int：不允许在reads两端出现大于多少bp的indel。 -l int：Read前多少个碱基作为seed，如果设置的seed大于read长度，将无法继续，最好设置在25-35，与-k 2 配合使用。 -k int：在seed中的最大编辑距离，使用默认2，与-l配合使用。 -t int：要使用的线程数。
-R int：此参数只应用于pair end中，当没有出现大于此值的最佳比对结果时，将会降低标准再次进行比对。增加这个值可以提高配对比对的准确率，但是同时会消耗更长的时间，默认是32。 -I int：表示输入的文件格式为Illumina 1.3+数据格式。 -B int：设置标记序列。从5’端开始多少个碱基作为标记序列，当-B为正值时，在比对之前会将每个read的标记序列剪切，并将此标记序列表示在BC SAM 标签里，对于pair end数据，两端的标记序列会被连接。
-b ：指定输入格式为bam格式。这是一个很奇怪的功能，就是对其它软件的bam文件进行重新比对的意思 bwa aln hg19.fa read.bam > read.fq.gz.sai
（3）生成sam格式的比对文件。如果一条read比对到多个位置，会随机选择一种。
例子：single end：
bwa samse hg19.fa read.fq.gz.sai read.fq.gz > read.fq.gz.sam 参数：
-n int：如果reads比对次数超过多少次，就不在XA标签显示。 -r str：定义头文件。‘@RG\\tID:foo\\tSM:bar’，如果在此步骤不进行头文件定义，在后续GATK分析中还是需要重新增加头文件。 pair end：
bwa sampe -a 500 read1.fq.gz.sai read2.fq.gz.sai read1.fq.gz read2.fq.gz > read.sam 参数：
-a int：最大插入片段大小。
-o int：pair end两reads中其中之一所允许配对的最大次数，超过该次数，将被视为
single end。降低这个参数，可以加快运算速度，对于少于30bp的read，建议降低-o值。
-r str：定义头文件。同single end。
-n int：每对reads输出到结果中的最多比对数。
对于最后得到的sam文件，将比对上的结果提取出来（awk即可处理），即可直接用于GATK的分析。
注意：由于GATK在下游的snp-calling时，是按染色体进行call-snp的。因此，在准备原始sam文件时，可以先按染色体将文件分开，这样会提高运行速度。但是当数据量不足时，可能会影响后续的VQSR分析，这是需要注意的。 2. 对sam文件进行进行重新排序（reorder）
由BWA生成的sam文件时按字典式排序法进行的排序（lexicographically）进行排序的（chr10，chr11…chr19，chr1，chr20…chr22，chr2，chr3…chrM，chrX，chrY），但是GATK在进行callsnp的时候是按照染色体组型（karyotypic）进行的（chrM，chr1，chr2…chr22，chrX，chrY），因此要对原始sam文件进行reorder。可以使用picard-tools中的ReorderSam完成。 eg.
java -jar picard-tools-1.96/ReorderSam.jar I=hg19.sam
O=hg19.reorder_00.sam REFERENCE=hg19.fa 注意：
1) 这一步的头文件可以人工加上，同时要确保头文件中有的序号在下面序列中也有对应的。虽然在GATK网站上的说明chrM可以在最前也可以在最后，但是当把chrM放在最后时可能会出错。
2) 在进行排序之前，要先构建参考序列的索引。
e.g. samtools faidx hg19.fa。最后生成的索引文件：hg19.fa.fai。
3) 如果在上一步想把大文件切分成小文件的时候，头文件可以自己手工加上，之后运行这一步就好了。
3. 将sam文件转换成bam文件（bam是二进制文件，运算速度快） 这一步可使用samtools view完成。
e.g. samtools view -bS hg19.reorder_00.sam -o hg19.sam_01.bam 4. 对bam文件进行sort排序处理
这一步是将sam文件中同一染色体对应的条目按照坐标顺序从小到大进行排序。可以使用picard-tools中SortSam完成。 e.g.
java -jar picard-tools-1.96/SortSam.jar INPUT=hg19.sam_01.bam OUTPUT=hg19.sam.sort_02.bam SORT_ORDER=coordinate
5. 对bam文件进行加头（head）处理
GATK2.0以上版本将不再支持无头文件的变异检测。加头这一步可以在BWA比对的时候进行，通过-r参数的选择可以完成。如果在BWA比对期间没有选择-r参数，可以增加这一步骤。可使用picard-tools中AddOrReplaceReadGroups完成。 e.g.
java -jar picard-tools-1.96/AddOrReplaceReadGroups.jar I=hg19.sam.sort_02.bam
O=hg19.reorder.sort.addhead_03.bam ID=hg19ID LB=hg19ID PL=illumine PU=hg19PU SM=hg19
ID str：输入reads集ID号；LB：read集文库名；PL：测序平台（illunima或solid）；PU：测序平台下级单位名称（run的名称）；SM：样本名称。