4 HH—2型数显恒温水浴锅
5取样器1 mL、5 mL各1支／组。
6 PHS-3C型pH计；上海雷磁仪器厂生产，配试剂时教师使用 7 100mL小烧杯：2只／组。 8电炉：公用。
9 500mL烧杯：公用。
10泡沫架(3孔)：1个／组。 11不锈钢镊子：公用。
1 2 100uL微量注射器：1支／组。 13透明塑料饭盒：1只／组。 14 Eppendorf管：公用。
15洗瓶(内装重蒸馏水)：1只／组。 16药勺：1支／组。 17刀片：1片／组， 18．脸盆：1个／组。 四、实验试剂
1．0.5 mg／mL的Marker标准蛋白质溶液：称取低相对分子质量的标准蛋白质Marker样品0.5 mg放人洁净的1.5 mL的Eppendorf管中，加入1mL“1×样品稀释液”(即“2×样品稀释液”再稀释1倍的产物)，使之溶解，再按每管100uL分装，贮存于-20℃冰箱中备用。
2．凝胶贮液：30 g丙烯酰胺，0．8 g亚甲基双丙烯酰胺，溶于100mL重蒸馏水，于4℃暗处贮存，一个月内使用。
3．lmol／L pH8．8的Tris—HCl缓冲液：Tris l21 g溶于重蒸馏水，用浓HCl调至pH8．8，以重蒸馏水定容至1 000 mL。
4．0.5 mol／L、pH6．8的Tris~HCl缓冲液：仿3配制。
5．10％(w／v)SDS：10 g的SDS定容于100 mL重蒸馏水中，SDS用分析纯，南京凯基生物科技发展有限公司生产，如是化学纯则需处理。
6．10％(w／v)过硫酸铵溶液(使用当天现配现用)：10 g过硫酸铵定容于100mI。重蒸馏水中。
7．四甲基乙二胺(TEMED)。
8．电极缓冲液(pH8.3)：Tris 30.3 g，甘氨酸144.2 g，SDS 10 g，溶于重蒸馏水并定容至1000 mL，使用时10倍稀释。
9．2×样品稀释液：SDS 500 g、β-巯基乙醇1 mI，、甘油3 mI。、漠酚蓝4 mg、1／L—pH6.8 Tris~HCl 2 mL，用重蒸馏水溶解并定容至10 mL，，按每份l mL分装于Eppendorf管中，一20℃贮存。此液制各样品时，样品若为固体，应稀释l倍使用；样品若为液体，则加人与样品等体积的原液混合即可。
10．固定液：500mL乙醇，100mL冰醋酸，用重蒸馏水定容至1 000 mL。 11．脱色液：250mL乙醇，80mL冰醋酸，用重蒸馏水定容至1 000 mL。 12．染色液：0.29 g考马斯亮蓝R250溶解在250mL脱色液中。 13．自制的粗酶溶液。 五、操作
1，制板：用酒精棉球擦拭制胶槽、玻璃板和盖板，并将其晾干。
将制胶玻璃板按照平、凹、平、凹顺序放人制胶槽内，一共放4套，盖上有机玻璃盖板，用四支夹子夹紧，受力点在密封条位置，务必密封，以防漏胶。
2，制胶
(1)制10％的分离胶
在小烧杯中，按表8—5—1的配方和顺序配制l0％浓度的分离胶，总量应根据制胶装置的大小而决定，本实验中45 mL左右，可制作4块胶。分离胶液混匀后，迅速用5 mL取样器吸取胶液，加至任意一个平、凹玻璃板间的间隙中，注意使胶液顺着凹面玻璃板的表面流下，加胶要迅速，由于4个平、凹玻璃板间的间隙是通过制胶槽底部的通道相通的，所以4个间隙中的液面会同时上升，当分离胶液面距离平面玻璃板顶端约2 cm处时停加胶液，参见图8—5—5。再用1 mL取样器向4个胶的液面上分别注入1 mL重蒸馏水，利用水的压力平衡分离胶的被面，使分离胶压制成一条直线，并且用于隔绝空气，在室温下放置40min左右，分离胶即可完全凝聚。然后把水倒掉，可见清晰的线状的分离胶液面。
注意：注入重蒸馏水时要快，避免产生过大的压力差，保证各分离胶液面等高。
(2)制5％的浓缩胶
按照表8—5—2配方及顺序配置5％的浓缩胶，总量应根据制胶装置的大小而决定，本实验为1 5 mL左右。将浓缩胶在小烧杯中混匀，迅速用5 mL取样器吸取胶液，沿着凹面玻璃板表面将其灌注在每块分离胶上，直至浓缩胶的液面达到平面玻璃板顶部，小心插人加样梳，避免混入气泡，将电泳槽垂直静置，直到浓缩胶完全聚合(一般为30min左右)。
凝聚后，小心取出加样梳，防止把点样孔弄破。用洗瓶冲洗点样孔，除掉未凝聚的丙烯酰胺等杂物。彻底倒出点样孔中的水，在其中加入已稀释的电极缓冲液。
3，样品处理：下面(1)、(2)两步中的加热操作同步进行。
(1)标准样品处理
先用电炉将烧杯中的自来水烧开，再取0.5 mg／mL的Marker标准蛋白质溶渡0.1mL加入Eppendorf管中，密闭，插到泡沫架上，用不锈钢镊子将泡沫架放到沸水浴中加热5min，取出，冷却至室温备用。
(2)待测样品处理
用自制的粗酶溶液作为待测样品，取待测液0.l mL．在Eppcndorf管中与2×样品稀释液等体积混匀．密闭，插到泡沫架上，用不锈钢镊子将泡沫架放到沸水浴中加热5min，取出，冷却至室温备用。 4，点样
松开制胶槽上的央子，取出中间夹有凝胶的平、凹两块玻板(二者粘在一起的，切勿分开，称作凝胶板三联体)，用自来水冲刷井用手抹去表面上的残余凝胶，选取两块做得比较好的凝胶板三联体，倾尽点样孔中的液体，以点样孔朝上，接凝胶板三联体(凹面玻璃朝外，平面玻璃朝内)、电泳槽芯、另一块凝胶板三联体、斜锲插板的排列顺序，装进电泳槽，并用斜锲插板插紧，牢牢固定。
用100 uL微量注射器取1 5uL处理过的蛋白质溶液，点到点样孔中。Marker标准蛋白质溶液点在正中央的点样孔中，待测蛋白质溶液分别点到左、右两边的点样孔中。注意要有间隔，每人记住自己的点样位置。
5，电泳
向电泳槽的内槽加入电极缓冲液使其溢出而流到外槽，使外槽中的电极缓冲液液面高度约为5 cm。
对准电泳槽芯的正负电极，盖上电泳槽的盖子，将整个电泳槽置于盛有自来水的盆中(作冷凝用)，某些型号的电泳槽自带冷凝装置，只要接上自来水就叫起到冷凝作用。将盖子的正、负电极插到电泳仪上的正、负极插孔中，将稳压旋钮调到最小，而稳流旋钮调到最大，插上电泳仪的电源插头。打开电源开关，调整稳压旋钮使电压处于150～300 V。设置电泳起始时间，即用快进和慢进按钮将时钟调整为0：00，再设置电泳结束时间，即在按住定时按钮的前提下用快进和慢进按钮将时钟调整为3：00，开始电泳，直至蓝色前沿迁移至离凝胶最下端约2 cm时，关掉电泳仪开关，拔下插头，停止电泳。 6，固定
从水盆中取出电泳槽，打开电泳槽盖子，将电泳槽内的电极缓冲液回收，取出斜楔插板，拿出夹着凝胶的玻璃板，将其置于盛有自来水的盆中。在平、凹两块玻璃板间隙之间．用药勺柄轻轻撬动，即可将胶面与平面玻璃板分开，再用刀片沿着凝胶与平面玻璃板的结合部位划开，抖动玻璃板使凝胶脱离玻璃板而滑人水中，用手轻轻将凝胶托起放入透明塑料饭盒中。加人固定液使凝胶浸没．晃动盒子使反应均匀，加盖密闭，室温下固定30 min，回收固定液。
7，染色
加入染色液使凝胶浸没，晃动盒子使反应均匀。加盖密闭，置于60℃恒温水浴锅中染色10min，回收染色液。 8，脱色
凝胶先用自来水洗去表面的残余染色液，加入脱色液使凝胶浸没，加盖密闭，置于60℃恒温水浴锅中加热l0min，更换新的脱色液再处理2次，最后将凝胶浸泡于蒸馏水中，脱色后的凝胶背景应为无色。
实验结果用数码相机拍摄电泳图谱，并打印出来贴在实验报告上，由的标准Marker蛋白的电泳图谱及其对应相对分子质量。参照酸性磷酸酯酶的相对分子质量55 000±5 000，在样品电泳图谱中判断样品中是否含有酸性磷酸酯酶，是否含有杂蛋白，并由区带色泽深浅
推测酸性磷酸酯酶和杂蛋白的相对量。请直接在电泳图谱上标明上述结论，包括组分名称(如酸性磷陵酯酶和杂蛋白)和相对分子质量范围。
注意，样品实际电泳图谱中标准Marker蛋白最上面的区带是相对分子质量为116.0 kDa的β-半乳糖苷酶。有条件的实验室还可以使用生物电泳分析系统进行拍照和进一步分析处理。 六、注意事项
1，PAGE电泳对水的要求非常高，必须用重蒸水或者某些市售的纯净水(如娃哈哈纯净水)，切勿使用自来水、矿泉水和一般蒸馏水。
2，丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺是神经性毒剂，对皮肤也有刺激作用，配试剂时须带医用手套，避免与皮肤接触。
3，丙烯酰胺和SDS的纯度直接影响实验结果的准确性。因此对不纯的丙烯酰胺和SDS试剂应进行重结晶处理。
4 ，SDS缓冲液在低温保存时产生沉淀。因此，SDS电泳应在室温中讲行。
5，温度对聚合速度影响显著，为保证凝胶质量，需根据室温变化适当调整凝胶浓度及催化剂用量。
6，电泳过程产生热量，温度过高会使区带扩散或蛋白变性，因此，电泳时需注意冷却装置或在0～4℃冰箱中进行。 思考题
1，为什么样品要在电泳前进行高温处理? 2，浓缩胶在电泳中起什么作用?
3，请在实验时注意观察，是点样前加电极缓冲液好还是点样后加电极缓冲液好?
4， 如果电泳过程中发现电泳槽的电极缓冲液液面在缓慢上升，这是什么原因造成的，应怎样解决？