实验六、蚕豆根尖微核检测技术（开放性实验）
一、实验目的
1. 了解微核测试原理和毒理遗传学意义。 2. 学习蚕豆根尖的微核测试技术。
二、实验原理
微核（micronucleus，MCN）是真核生物细胞经各种理化因子作用后引起染色体畸变，在间期细胞中的一种表现形式。在细胞间期，微核呈圆形或椭圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3～1/10之间，染色与主核一样或稍浅。一般认为微核是由无着丝粒的染色体断片或落后染色体，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。当子细胞进入下一次分裂间期时，它们便浓缩成主核之外的小核，即微核。
用微核试验来评价药物、放射线、有毒物质等对人体细胞或体外培养细胞遗传学损伤仍是一个直观有效可行的方法，在遗传毒理、医学、食品、药物、环境等诸多方面得到了广泛的应用。
利用蚕豆根尖作为实验材料进行危害测试，可准确地显示各种处理诱发畸变的效果，并可用于污染程度的监测。
三、实验器材和药品
青皮蚕豆、显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、烧杯、Carnoys固定液、盐酸酒精解离液、改良苯酚品红染液。
四、实验步骤
1. 浸种催芽：择饱满、均匀的种子，洗净后用蒸馏水常规浸种24～30 h，此期至少换水2次；待种子充分吸胀后，移入铺有干净、双层湿纱布的托盘内催芽，待大部分初生根长至 1～2 cm时，按照自行设计的实验方案进行染毒处理。
2. 用被检测液处理根尖：选初生根生长良好的蚕豆6～8粒，分别放入自行设计的染毒液中进行染毒处理。
3. 根尖细胞恢复培养：处理后的种子用蒸馏水（自来水）浸洗3次，每次2～3 min；将处理液洗净后，置于湿纱布上恢复培养22～24 h；同时均设蒸馏水处理为空白对照组。以上温度均为25℃。
4. 根尖细胞固定：将恢复后的种子，从根尖顶端切下1～1.5 cm长的幼根，用Carnoys固定液固定20～24 h。固定后的根如不及时制片，可换入70%的酒精溶液中置4℃冰箱中保存备用。
5. 酸解：用蒸馏水浸洗固定好的幼根3次，每次5 min，吸净蒸馏水，加入1 mol 盐酸解离液室温下酸解10～12 min，幼根软化即可。
6. 染色：吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根3次，每次1～2 min。最后浸于水中。制片前取出置载玻片上，截下1～2 mm左右长的根尖，滴1～2滴改良苯酚品红染液染色5～8 min
11
后，加上盖玻片，覆以吸水纸常规压片。
五、实验结果
在显微镜低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察微核。每一处理观察3个根尖，每个根尖数1000个细胞，统计其中含微核的细胞数，然后平均，即为该处理的MCN%，即微核千分率，以此可作一个检测指标。
根据你的实验安排列表填出你的实验结果。
污染指数（PI）=样品实测MCN%平均值/对照组MCN%平均值
污染指数在0～1.5区间基本没有污染；1.5～2区间为轻度污染；2～3.5区间为中度污染；3.5以上为重度污染。
六、作业
1. 在蚕豆根尖细胞的微核测试中，为什么要进行恢复培养？
2. 产生微核的根尖细胞在产生前的分裂中期可能出现什么样的中期分裂图象？实验观察中请同时仔细观察每个分裂相细胞。
实验七、 人体皮纹的遗传分析
一、实验原理
人体的皮肤由表皮和真皮组成。真皮乳头向表皮突起，构成许多整齐的乳头线称为嵴线(ridge)。嵴线之间凹陷部分称为沟(furrow)。皮肤表层因皮嵴和皮沟走向不同而形成各种图形，称为皮肤纹理(dermatoglyphy)，简称皮纹。皮纹在胚胎发育的第12~13周开始，第19周左右形成，其形态终身不变，主要分布于手掌、手指、脚掌、脚趾等部位。
国际上公认Galton是现代皮纹学的创始人，他(1892)所撰写的《指纹》一书，具体地提出了弓、箕、斗的指纹构型分类，与目前的分类法十分相似，并提出了指纹的可遗传性。Elderdon(1920)发表《指纹的遗传》，为最早论述指纹遗传的论文。Bonnevie(1924)提出皮纹属于多基因遗传的假说，用指纹的形态指数(form index)方法研究指纹的亲子关系。皮纹学(dermatoglyphics)一词，是Cummins和Midlo于1926年首先提出的，并最早报道了先天愚型(Down氏综合征)患者的特异性皮纹特征，为皮纹学应用于临床诊断和疾病研究开辟了新途径。皮纹学是研究皮纹的形态特征、发生、遗传变异规律及其应用的学科。目前广泛应用于人类学、遗传学、法医学及临床诊断等领域，我国是世界上公认的指纹术的发源地，是最早应用指纹、掌纹的国家。
人体的皮肤纹理属多基因遗传，具有高度的个体特异性。其遗传方式有显性、隐性、中间性、不完全显性、不完全外显率及不同表现度等多种形式。
二、实验材料
本校各院系学生或某一区域人群。
三、实验仪器与试剂 1.仪器
放大镜，量角器，直尺，铅笔，印油(或黑色油墨)，海绵垫，白纸，印图纸，搪瓷盘，镊
12
子等。
2.试剂
亚铁氰化钾，三氯化铁，茚三酮，氨基酸(组氨酸、谷氨酸或精氨酸等均可)等。
四、操作程序 1.皮纹采样方法
通常采用直接观察法、油墨法、茚三酮-氨基酸颜色反应法、普鲁士蓝颜色反应法、掌纹捺印盒等，具体操作见附录。
茚三酮-氨基酸颜色反应法和普鲁士蓝颜色反应法，操作简便，显色清晰，不易褪色，便于长期保存。且无异味，不污手足，易于受检者接受。 2.指纹分析
对手指端的纹理进行观察，辨别弓形纹、箕形纹、斗形纹3种类型，其各自形态特征见附录图2。 3.嵴纹计数(ridge count)
从箕形纹或斗形纹的中心点到三叉点的中心画一直线，再计算直线经过的嵴纹数。因弓形纹没有三叉点，所以计数为0；箕形纹按上述方法计数(附录，图4)；斗形纹因有2个交叉点，需经2次计数，并按较大的数计(附录，图5)；双箕斗形纹有2个三叉点和2个中心，嵴纹计数时，先将2个三叉点与距它们较近的中心以及2中心点间用直线连接起来，分别记录3条直线上通过的嵴纹数目，最后将3个数字相加，得到的数除以2，所得数值就是双箕斗形纹嵴纹数目(附录，图5d)。 4.总指嵴数(tota1finger ridge count，TFRC)
将左右手10个手指末端嵴纹数相加的总和，是表示指端各种纹形比例和大小的指标。总指嵴数的绝对增多或减少可为异常，若十指均为弓形纹,其嵴纹数为0，则总指靖数也为0。 5.掌纹分析
掌纹皮纹嵴线构成多种花纹，其中弓形纹称为非真实花纹，斗形纹和箕形纹称为真实花纹。具体掌纹分析见附录。
6.a-b嵴线数(a-b ridge count，a-b RC)
在三叉点a和b之间作一直线，除去起止点计算所经过的嵴线数，即得a-b RC值，该值可作单手或双手计算。中国人a-b RC正常值为：男性左手37.4±4.84，右手37.2±5.03；女性左手37.2±5.54，右手37.2±5.63。两手之和明显低于欧美人种。 7.atd角和t距比测量
在手掌近腕处大小鱼际交界的位置存在一个三叉点称为轴三叉或轴三角，常用t表示(图 1a)。t距是t三叉点距远侧腕关节褶线的距离，正常成年人的t距为0.5~3cm，一般认为中
国汉族成人的t距小于2cm。若该三叉点向掌心方向移位，称为t′三叉；若移位到掌心附近，则称为t＂三叉。t′和t＂常见于三体综合征患者。
轴三叉的位置可用atd角表示。atd角指三叉点a和三叉点d分别引一直线连接轴三叉t所形成的夹角。中国正常人群的atd角小于45°，平均41°，用t表示；若atd角在45°~56°之间，用t′表示；若atd角大于56°，则用t＂表示。
轴三叉位置的另一测量指标为t距比(percent distance of axial triradius，tPD)，指t距与手掌长(中指基部的指掌褶线距远侧腕关节褶线的距离)的比值，用%表示(图1b)。正常比值t为0~14%，t′为15%~39%，t＂为大于40%。
13
图1 atd角、t距比及其测量
8.掌褶纹和指褶纹
在手掌和手指的屈面各关节弯曲活动的地方可见到明显的皮肤皱褶，称为掌褶纹(palmar flexion crease)和指褶纹(digita1 flexion crease)。它们虽不属于皮肤纹理，但由于某些染色体病患者的掌褶纹和指褶纹常有特异性改变，故观察分析它们对某些遗传病的诊断有一定参考价值。
正常人除拇指仅有1条指褶纹外，其余4指均有2条指褶纹，13三体、18三体、21三体综合征患者小指仅有1条指褶纹。
正常人的掌褶纹有3条：远侧横褶纹、近侧横褶纹、大鱼际褶纹，这3条褶纹的分布可出现变异，常见有：通贯手、过渡I型、过渡Ⅱ型、悉尼手。 具体描述见附录。 9,足掌纹
足掌纹也称跖纹(sole pattern)，是脚掌面的皮纹，由于足掌面上有较多的三叉点，因而其花纹更为复杂。在人的脚趾、脚掌的皮肤纹理中，拇趾球部的皮纹(hallucal area pattern)研究较多且有使用价值。拇趾球部是人足第一跖骨与拇趾第一趾骨相关连处的膨大区域，此区出现的各种皮嵴花纹也可分为弓、箕、斗等，一般按照拇趾球部弓、箕、斗等纹线在胫侧、腓侧以及远侧的走向分为7种类型：远侧箕形纹、胫侧箕形纹、腓侧箕形纹、胫侧弓形纹、腓侧弓形纹、近侧弓形纹、斗形纹。 具体描述见附录。
五、实验结果与分析 1.指纹分布的一般规律
左右手指纹花样分布有明显不同，左手弓、正箕和反箕的出现率比右手高，斗的出现率则右手比左手高。大多数人群中，弓形纹出现率依次为食指、中指、拇指、小指、环指；正箕出现率依次为小指、中指、食指、拇指、环指；反箕出现率依次为食指、中指、拇指、环指、小指；斗的出现率依次为环指、拇指、食指、中指、小指。男女之间指纹花样出现率大多具有显著的差异，一般男性的斗纹和箕纹的出现率比女性高，而正箕和弓纹的出现率则女性高于男性。 2.嵴纹计数与总指嵴数
绝大多数人群男性的平均总指嵴数大于女性，多数人群右手的总指嵴数比左手的多，但每一人群中男女之间和左右手之间平均总指嵴数的差异大多不显著。不同手指上嵴纹数的多少不同，中国人群中一
14
般以拇指最多，依次为环指、中指、食指、小指，总指嵴数在中国各人群中的变动范围为97.20~171.25条。在世界范围内，波利尼西亚人、日本人、夏威夷人、菲律宾人等太平洋人群的总指嵴数较多，而葡萄牙人、波多黎各人、高加索人等大西洋人群的总指嵴数较少。 ⒊掌纹中各花纹的一般规律
Th/I1区的真实花纹中以箕纹出现率最高，在有的人群中可达10%，其他真实花纹出现率一般不超过2.0%。在多数人群中男性的真实花纹出现率高于女性，但差异大多数不显著。而几乎所有人群左手的真实花纹出现率高于右手，并差异显著。
小鱼际区的真实花纹出现率以反箕最高，多数人群中女性的真实花纹出现率比男性高，而两手相比，左手的真实花纹出现率比右手高。
指间区I2、I3、I4中，以指间区I4的真实花纹出现率最高，其次是指间区I3，最低为指间区I2。多数人群中指间区I2、I3的真实花纹出现率男性超过女性，而指间区I4的出现率则女性超过男性。指间区I2、I3的真实花纹出现率右手高于左手，而指间区I4则相反，即左手高于右手。各指间区的真实花纹出现率在性别、左右侧之间的差异在多数人群中均不显著。 4.a-b嵴线数
大多数人群中的平均a-b嵴线数男性多于女性，左手的平均a-b嵴线数比右手的多，但差异都不显著。 5.atd角与t距比
在人的生长发育时期，atd角的大小随年龄增加而变小，因此对所调查人群的atd角数据分析时，要考虑到年龄因素的影响。绝大多数人群的女性atd角大于男性，且差异大多数具有显著性。左手的atd角一般比右手大，但差异大多不显著。t距比在我国少数民族中多在17.0%以上，变动范围从15.31%(宁夏回族)~20.99%(基诺族)。
各种先天性大脑发育不全的遗传性疾病，如先天性愚型、13三体综合征，XO综合征等都有atd角明显增大，均值高达56°~64°的显著特征。因此，atd角被认为在一定程度上有助于判断人的机敏程度。各项优秀运动员的均值，男子仅在37°~39°，女子在39°~40°。一般对临场应变能力要求高的项目其运动员的atd角比以固定程式比赛项目的小；田径中技巧群(跳高、跳远、跨栏)比跑群和投掷群的atd角小；体操中参加全能项的运动员比仅参加单项运动员的atd角小。 6,掌褶纹
在中国正常人群中，通贯手有3%~5%，过渡I型有10%~15%，过渡Ⅱ型有3%~6%，悉尼手有2%~5%。13三体和18三体综合征患者双手为通贯手出现率比正常人高出10~30倍。中国人的普通型中女性高于男性，而变异型的出现率男性超过女性。人群中普通型、悉尼手、过渡Ⅱ型左手的出现率比右手高，通贯手和过渡I型出现率则右手高于左手，但多数人群中不同性别之间和左右手之间的差异不显著。 7.拇趾球部的皮纹
中国人群拇趾球部的皮纹中真实花纹出现率以远侧箕形纹最高，平均为60.95%；其次是简斗，平均出现率为20.77%；胫侧箕形纹与胫侧弓形纹，其平均出现率分别为7.54%与⒋72%，而先天愚型患者胫侧弓形纹高达72%；腓侧箕形纹出现率平均为0.30%，而13三体综合征患者高达42%。 8.皮纹调查统计与比较
将所调查的人群皮肤纹理填写在表1中，统计分析并写出相关调研报告。
表1 皮纹调查统计表 姓名 项目 指（趾） 皮纹类型 嵴纹计数 总指嵴数
性别 左 年龄 民族 日期 右 编号 合计 拇指 食指 中指 环指 小指 拇指 食指 中指 环指 小指 15