第２１卷第３期２０１２年６月
中国组织化学与细胞化学杂志
ＣＨＩＮＥＳＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＨＩＳＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹＡＮＤＣＹＴＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ
Ｖｏｌ．２１．Ｎｏ．３Ｊｕｎｅ．２０１２
Ｔ２
他莫昔芬诱导的Ｃｒｅ重组酶在ｈＧｆａＣｒｅＥＲｐ
转基因鼠小脑中的表达研究
郭志宝 王义辉 张 强 喻志源 谢敏杰 王 伟＊
（）华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科，武汉４３００３０
２
摘要〕转基因鼠小脑中表达ＣＧｆａＣｒｅＥＲＴｒｅ重组酶的细胞类型。方法 ｈＧｆａＣｒｅ 〔 目的 探讨他莫昔芬诱导的ｈ－ｐｐＴ２
对小脑组织切片行Ｘ然后用细ＥＲ／Ｒｏｓａ２６Ｒ转基因小鼠在胚胎晚期和出生早期用他莫昔芬诱导Ｃｒｅ重组酶表达，ａｌ染色，－ｇ
）、）胞种类特异性抗体进行免疫组织化学染色，并和Ｘ第１和第６ａｌ染色双重标记。结果 在出生后第７天（Ｐ７４天（Ｐ１４０天－ｇ
（），、和神经元抗体Ｎ浦肯野细胞抗体ＣＰ６０Ｘａｌ阳性染色和胶质细胞抗体Ｂｌｂｅｕｎａｌｂｉｎｄｉｎ及少突胶质细－ｇｐ阳性染色共标记，
Ｔ２
）胞前体细胞抗体ＮＧ后用他莫昔芬诱导ｈ发现Ｃ２不共标。结论 自胚胎晚期第１７．５天（Ｅ１７．５ＧｆａＣｒｅＥＲ转基因鼠，ｒｅ重ｐ
组酶特异性在小脑星形胶质细胞中表达，不在神经元、浦肯野细胞、少突胶质细胞前体细胞中表达。
〔关键词〕ｒｅ重组酶； 小脑； Ｃ 胶质细胞〔：／中图分类号〕文献标识码〕３２２．８１１ 〔ＯＩ１０．３８７０ｚｚｚｈｘ．２０１２．０３．００５ Ｒ Ａ Ｄｇ
ＥｘｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｉｎｄｕｃｅｄｂｔａｍｏｘｉｆｅｎｉｎ ｐｙ
Ｔ２
ｈＧｆａＣｒｅＥＲｔｒａｎｓｅｎｉｃｍｏｕｓｅｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ ｐｇ
＊，Ｗ，，，，ＷＧｕｏＺｈｉｂａｏａｎＹｉｈｕｉＺｈａｎＱｉａｎＹｕＺｈｉｕａｎＸｉｅＭｉｎｉｅａｎＷｅｉ ｇｇｇｙｊｇ
（ＤｅａｒｔｍｅｎｔｏＮｅｕｒｏｌｏＴｏｎｉ Ｈｏｓｉｔａｌ，Ｔｏｎｉ Ｍｅｄｉｃａｌｃｏｌｌｅｅ，ＨｕａｎｚｈｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔ ｐｆ ｇｙ，ｇｊｐｇｊｇｇｇ ｙｏＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ ＴｅｃｈｎｏｌｏＷｕｈａｎ４３００３０，Ｃｈｉｎａ） ｆ ｇｙ，
〔〕ＡｂｓｔｒａｃｔｂｅｃｔｉｖｅＴｏｉｎｖｅｓｔｉａｔｅｔｈｅｃｅｌｌｓｔｌｅｓｏｆＣｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎｄｕｃｅｄｂｔａｍｏｘ Ｏ －ｊｇｙｐｙ
Ｔ２
ｉｆｅｎｉｎｈＧｆａＣｒｅＥＲｔｒａｎｓｅｎｉｃｍｉｃｅ．ＭｅｔｈｏｄｓＴａｍｏｘｉｆｅｎｉｎｅｃｔｉｏｎｗａｓｕｅｓｄｔｏｉｎｄｕｃｅＣｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｐｇｊ
Ｔ２
ｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈＧｆａＣｒｅＥＲ／Ｒｏｓａ２６Ｒｔｒａｎｓｅｎｉｃｍｉｃｅａｔｌａｔｅｅｍｂｒｏｎｉｃａｎｄｅａｒｌｓｔａｅ．Ｃｅｌｌｓｏｓｔｎａｔａｌ ｐｐｇｙｙｇｐ
，ｅｘｒｅｓｓｉｎＣｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｗｅｒｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｂＸａｌｓｔａｉｎｉｎａｎｄｔｈｅｎｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｗａｓ －ｇ ｐｇｙｇｇ
ｔｏｉｄｅｎｔｉｆｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓｔｌｅｓ．ＲｅｓｕｌｔｓＡｔＰ７，Ｐ１４ａｎｄＰ６０，Ｘｃｅｌｌｓｃｏｅｘｒｅｓｓｅｄｔｈｅａｓｔｒｏｕｓｅｄａｌｏｓｉｔｉｖｅ －ｇ －ｙｙｐｐ
ｒａｎｕｌｅｒｅｃｔｅｍａｒｋｅｒｂｌｂｂｕｔｎｏｔｃｅｌｌｍａｒｋｅｒｎｅｕｎ，Ｐｕｒｋｉｎｅｃｅｌｌｍａｒｋｅｒｃａｌｂｉｎｄｉｎｏｒｏｌｉｏｄｅｎｄｒｏｃｔｅ －ｇｐｙｐ，ｊｇｙ
），ｃｕｒｓｏｒｃｅｌｌｍａｒｋｅｒＮＧ２．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＦｒｏｍｔｈｅｌａｔｅｅｍｂｒｏｎｉｃｓｔａｅ（Ｅ１７．５Ｃｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｉｎｄｕｃｅｄｂ ｙｇｙ
Ｔ２
ｉｎｈＧｆａＣｒｅＥＲｔｒａｎｅｎｉｃｍｉｃｅｉｓｅｘｒｅｓｓｅｓｅｄｉｎａｓｔｒｏｃｔｅｓｏｆｔｈｅｍｏｕｓｅｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ，ｎｏｔｉｎｔａｏｍｏｘｉｆｅｎ ｐｇｐｙ，ｒａｎｕｌｅｃｅｌｌＰｕｒｋｉｎｅｃｅｌｌｓｏｒｏｌｉｏｄｅｎｄｒｏｃｔｅｒｅｃｕｒｓｏｒｃｅｌｌｓ． ｇｊｇｙｐ
〔〕；Ｋｅｗｏｒｄｓｅｒｅｂｅｌｌｕｍ；ｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｌｉａｌｃｅｌｌ Ｃ Ｃ Ｇ ｙ
转基因技术取 随着分子生物学技术的迅猛发展，
／得了重大的进步，其中ＣｒｅＬｏｘｐ条件性基因敲除技术发挥着越来越重要的作用。传统的基因敲除技术是将机体所有细胞的靶基因敲除，虽然为研究基因的功能提供了很大的便利，但是也有难以克服的缺点，比如胚胎早期基因敲除的致死性阻止了进一步研究该基因在出生后的功能，或者基因在多个器官
１］
。Ｃ／的敲除带来敲除效应分析的复杂性［ｒｅｌｏｘｐ
靶基因ｌ杂酶转基因小鼠和靶基因钳制小鼠（ｏｘｐ）交，从子代小鼠中得到细胞种类特异性Ｃｒｅ重组酶／靶基因ｌ从而实现将特异种类细胞ｏｘｐ转基因小鼠，的靶基因敲除，这为研究靶基因在特异组织和器官
２］
。胶质纤维酸性蛋的功能研究提供了极大的便利［
，白（在神经系ＧｌｉａｌｆｉｂｒｉｌｌａｒａｃｉｄｉｃｒｏｔｅｉｎＧＦＡＰ） ｙｐ
３］
。研究者将统中是星形胶质细胞特异性的标记物［
条件性基因敲除技术是将细胞种类特异性Ｃｒｅ重组
基因启动子置于ＣｈＧＦＡＰ（ｈｕｍａｎＧＦＡＰ）ｒｅ重组
酶基因上游，构建了ｈ但是后ＧｆａＣｒｅ转基因小鼠，ｐ来的研究证实在ｈＧｆａＣｒｅ转基因小鼠中，Ｃｒｅ重组ｐ酶并非在胶质细胞中特异性表达，Ｃｒｅ重组酶除了在神经元、少突胶质细胞在胶质细胞中大量表达外，
］４５－，也有大量表达［这不利于特异性研究胶质细胞的
〔收稿日期〕修回日期〕２０１２０１１３２０１２０３３０－－ 〔－－〔）基金项目〕国家杰出青年基金资助（３０７２５０１９〔，作者简介〕郭志宝，男（汉族，博士研究生。１９８１年））Ｔｏｗｈｏｍｃｏｒｒｅｓｏｎｄｅｎｃｅｓｈｏｕｌｄｂｅａｄｄｒｅｓｓｅｄ＊通讯作者（ ｐ
基因与功能。研究者又构建ｈＧｆａＥＲＴ２（ｈＧＦＡＰ－ｐ
第３期郭志宝等．他莫昔芬诱导的Ｃｒｅ重组酶在ｈＧｆａＣｒｅＥＲＴ２转基因鼠小脑中的表达研究ｐ
２３１
）转基因鼠，ＣｒｅｅｓｔｒｏｅｎＲｅｃｅｔｏｒｈＧｆａＥＲＴ２转基－ ｇｐｐ因鼠是将雌激素受体的配体结合区关键氨基酸突然后和Ｃ变，ｒｅ重组酶基因进行融合产生嵌合重组酶基因，再将该嵌合重组酶基因置于ｈＧｆａｐ启动子调控下，只有在外源性给他莫昔芬诱导时，Ｃｒｅ重组酶基因才得以表达。通过对外源性给予他莫昔芬时间的选择，从而实现靶基因基因敲除的时间特异
］６７－。Ｒ性［ｏｓａ２６Ｒ转基因小鼠是常用的ｃｒｅ基因报８］，其基因中包含Ｌ告鼠［ａｃＺ基因以及该基因上游
３．实验方法３．１他莫昔芬诱导
６，９］
。用玉米油配他莫昔芬给药剂量参考文献［
／，制他莫昔芬终浓度为５分装后－０ｍｋ２０℃避光ｇｇ）保存。胚胎晚期（孕１孕鼠腹腔注射他莫昔芬７．５ｄ（／，出生后Ｐ１００ｍｋＰ７取幼鼠脑组织；０和Ｐ５ｇｇ）
／，给予幼鼠腹腔注射他莫昔芬（分别于７５ｍｋｇｇ）Ｐ１４和Ｐ６０取脑组织。
３．２标本处理
腹腔注射１％戊巴比妥钠麻醉小鼠，先用生理盐水快速灌注左心室，然后用４℃预冷的４％多聚甲醛充分灌注，４℃冰箱中４％多聚甲醛后固定２ｈ。然后３冰冻０％蔗糖脱水沉底。ＯＣＴ包裹后速冻，片厚２切片机做小脑矢状切片，０ｍ。μ
３．３Ｘａｌ染色和免疫组化双重标记－ｇ
［］
先行Ｘａｌ染色６－７，３７℃恒温箱孵育数小时，－ｇ染色阳性细胞呈蓝色，当染色深度合适时，用ＰＢＳ漂洗数次停止染色。需和免疫组织化学染色双重标
９］
，记时，接着行免疫组织化学染色［然后ＤＡＢ显
色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学
被ｌ当ｃｏｘｒｅ重组酶有活ｐ序列钳制的终止子序列，性时将ｌ终止子下ｏｘｐ序列钳制的终止子序列切除，游的ＬａｃＺ基因表达。ＬａｃＺ基因的表达产物是β－半
），乳糖苷酶（在βａｌａｌ是βａｌ的底物，ａｌ存Ｘ－－ｇ－－ｇｇｇβ因此可以通在的条件下，Ｘ－Ｇａｌ反应生成蓝色产物，过Ｘ进而间接指示ｃａｌ染色检测βａｌ的表达，ｒｅ－ｇ－ｇ
重组酶基因的表达。
２
本研究是将ｈ转基因小鼠和ＣＧｆａＣｒｅＥＲＴｒｅｐ２
／基因报告鼠Ｒ得到ｈｏｓａ２６Ｒ杂交，ＧｆａＣｒｅＥＲＴｐ
然后在不同时间点用他莫昔Ｒｏｓａ２６Ｒ转基因小鼠，
芬诱导Ｃ通过Ｘｒｅ重组酶表达，ａｌ染色并和细胞－ｇ特异性抗体免疫组织化学染色双重标记分析表达ｃｒｅ重组酶的细胞类型。
材料和方法
１．实验动物
２
转基因小鼠来自美国北卡罗莱ｈＧｆａＣｒｅＥＲＴｐ
［６］
由浙江大学医学院段纳大学ＭｃＣａｒｔｈｙ实验室，
显微镜下观察。
结 果
１．胚胎晚期他莫昔芬诱导的Ｃｒｅ重组酶特异性地表达于星形胶质细胞
ａ１染色阳性细胞分布特征１．１Ｘ－ｇ
ａ１染色阳性细胞胞体分布于外颗粒细胞层Ｘ－ｇ
（，和内颗粒细胞层（ｒａｎｕｌａｒｅｘｔｅｒｎａｌｃｅｌｌＥＧＬ）ｉｎ －ｇ
，之间，阳性突起短小，向小ｔｅｒｎａｌｃｅｌｌＩＧＬ）ｒａｎｕｌａｒ ｇ，脑表面延伸。在ＩＧＬ及白质区（ｗｈｉｔｅｍａｔｔｅｒ
也有少数ＸＷＭ）ＥＧＬ几乎观ａ１阳性细胞分布，－ｇ。察不到Ｘ图１Ａ）ａ１阳性细胞存在（－ｇ
ａｌ染色和免疫组织化学染色双重标记１．２Ｘ－ｇ
出生后７天，ａｌ染色和Ｂｌｂ①Ｘ－ｇｐ双重标记：ＢｌｂＧＬ内侧及ＩＧＬ和ｐ阳性的细胞胞体主要位于Ｅ
几乎所有ＸＷＭ。Ｘａｌ染色和Ｂｌｂ－ｇ－ｐ大量共标记，。②Ｘ图２ａｌ阳性细胞胞体都有ＢｌｂＤ，Ｇ）－ｇｐ表达（
ａｌ和Ｎｅｕｎ双重标记：Ｘａｌ染色阳性细胞和Ｎｅ－ｇ－ｇ
ｕｎ阳性的细胞分布在ＥＧＬ和ＩＧＬ，Ｘａｌ阳性细胞－ｇ
。③Ｘ胞体无Ｎ图２ｅｕｎ表达（Ｅ，Ｈ）ａｌｂｉａｌ和Ｃ－ｇ－浦肯野细胞形成单层细胞，胞体排ｎｄｉｎ双重标记：
列在Ｅ其树突朝向小脑表面伸展。ＧＬ和ＩＧＬ之间，，其胞体毗邻浦肯Ｘａｌｂｉｎｄｉｎａｌ阳性细胞不表达Ｃ－ｇ
。野细胞胞体排列（图２Ｆ）
树民教授实验室提供。ＲｏｓａＬａｃＺ转基因小鼠从－ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒ ｙ购买。
２．主要仪器和试剂２．１主要仪器
，光学显微镜（冰冻切片机Ｏｌｍｕｓ公司）ｙｐ
（，，高速离心机（Ｌｅｉｃａ公司）Ｅｅｎｄｏｒｆ公司）ＰＣＲｐｐ
。仪（Ｂｉｏｒａｄ公司）－２．２主要试剂
），），他莫昔芬（兔抗小Ｘａｌ（ＡｍｅｒｅｓｃｏＳｉｍａ－ｇｇ，，鼠Ｂ鼠抗小ＬＢＰ多克隆抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎａｂ９５５８），），鼠Ｎ兔抗小ＥＵＮ多克隆抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎｍａｂ３７７，，鼠ｃａｌｂｉｎｄｉｎＳｉｍａｃ２７２４）Ａｎｔｉ－Ｄ多克隆抗体（－ｇ
，ＮＧ２ＣｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎＳｕｌｆａｔｅＰｒｏｔｅｏｌｃａｎ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ ｇｙ），二步法抗小鼠免疫组化检测试剂盒和二步ａｂ５３２０
法抗兔免疫组化检测试剂盒（上海基因科技有限公，司）北京中杉金桥生物技术有限公ＤＡＢ试剂盒（。司）
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中国组织化学与细胞化学杂志
第２１卷
２．出生当天他莫昔芬诱导的Ｃｒｅ重组酶特异性地表达于星形胶质细胞
２．１Ｘａ１染色阳性细胞分布特征－ｇ
Ｐ１４小脑切片中Ｘａ１染色阳性细胞多数分布－ｇ于ＩＧＬ和ＷＭ。胞体位于ＥＧＬ和ＩＧＬ之间的细胞胞体伸出长突起放射到小规则的排列成单层细胞，
脑表面。局部脑叶放大图中可发现在ＥＧＬ散在分。布Ｘ图１ａ１阳性染色细胞的胞体（Ｂ）－ｇ
２．２Ｘａｌ染色和免疫组织化学染色双重标记－ｇ
４天，Ｂｌｂ①出生后１ｐ抗体标记的胶质细胞主要分布在浦肯野细胞层（和ＩＰＣＬ）ＧＬ。在ＥＧＬ和ＩＧＬ间Ｘａｌ阳性细胞的胞体分散在浦肯野细胞胞－ｇ
），）。在Ｉ体的周围（图３同时有Ｂ图３ＩｌｂＩＧＬｐ表达（和ＷＭ区，Ｘｌｂａｌ阳性细胞和Ｂ－ｇｐ可以很好的共标
）。②Ｃ记（图３Ｊａｌｂｉｎｄｉｎ抗体标记的浦肯野细胞胞体在Ｅ突ＧＬ和ＩＧＬ间规则的排列形成单层细胞，起向脑膜方向放射状排列。Ｘａｌ阳性的细胞胞体－ｇ分散在前者的胞体周围，两种染色无共定位（图。③Ｎ少数３Ｋ）ｅｕｎ标记的神经元大量分布于ＩＧＬ，
分布在ＥＧＬ。在ＥＧＬ靠近脑膜处有少量Ｎｅｕｎ阳性的细胞聚集，在ＥＧＬ可观察到Ｎｅｕｎ阳性染色细。Ｅ胞沿着放射状纤维排列（图４）ＧＬ和ＩＧＬ内Ｘ－（。图４ａｌ染色阳性的细胞都不表达ＮｅｕｎＬ，Ｍ）ｇ
出生后５天他莫昔芬诱导的Ｃ３．ｒｅ重组酶特异性地表达于星形胶质细胞
ａ１染色阳性细胞分布特征３．１Ｘ－ｇ
成年后Ｘａｌ阳性细胞主要分布于分子层（ｍｏ－ｇ－，和Ｉ胞体在两层之间规则ｌｅｃｕｌａｒｌａｅｒＭＬ）ＧＬ间， ｙ
排列形成单细胞层，突起呈放射状伸向小脑表面。在ＩＧＬ和ＷＭ区有少量Ｘａｌ染色阳性细胞分布－ｇ（。图１Ｃ）
３．２Ｘａｌ染色和免疫组织化学染色双重标记－ｇ
０天，Ｂｌｂｅｒｍａｎｎ①在出生后６ｐ抗体标记的Ｂｇ胶质细胞和星形胶质细胞胞体都有Ｂ图ｌｂｐ表达（。②Ｎ５Ｎ）ｅｕｎ抗体标记的神经元主要分布在ＩＧＬ
层，ＭＬ也有少数Ｎｅｕｎ染色阳性细胞。在ＭＬ和图５Ｏ，ＩＧＬ，Ｘａｌ染色阳性细胞都不表达Ｎｅｕｎ（－ｇ；Ｒ）２抗体标记的少突胶质细胞前体细胞分部③ＮＧ在ＭＬ和ＩＧＬ，Ｘ２ａｌ染色阳性的细胞不表达ＮＧ－ｇ（）；图５Ｐ，Ｓａｌｂｉｎｄｉｎ抗体标记的浦肯野细胞胞④Ｃ体位于ＭＬ和Ｉ规则地排列形成单层细ＧＬ之间，胞，树突向脑膜方向伸展。Ｘａｌ染色生成的蓝色－ｇ沉积物毗邻浦肯野细胞胞体周围，但是二者不共定。位（图５Ｑ）
讨 论
神经组织主要由神经元和神经胶质细胞组成。星形胶质细胞是神经胶质细胞中最主要的成分，主要包括纤维性星形胶质细胞和原浆性星形胶质细胞。另外，在发育中起重要作用的大脑中放射状胶）、质细胞（小脑中贝格曼细胞（ｒａｄｉａｌＢｅｒｍａｎｎｌｉａ ｇｇ）以及视网膜中的Ｍｃｅｌｌüｌｌｅｒ细胞都属于星形胶质
１０］
。近几年的研究发现星形胶质细胞除了支细胞［
持、隔离神经元，为神经元提供营养和保护作用外，
］１１１３－。还能够诱导突触形成及成熟、调节突触传递［
研究表明在出生后小脑中，Ｂｌｂｐ特异性地表达，于星形胶质细胞（包括Ｂ免疫ｅｒｍａｎｎ胶质细胞）ｇ
［１４］
电镜结果显示ｂｌｂｐ在细胞核和胞浆均有分布。
ＧＦＡＰ是神经系统中星形胶质细胞特异性表达的蛋白标记物。小脑中ｈＧＦＡＰ基因启动子介导的ｃｒｅ重组酶基因的表达最早在胚胎１４．５天可以检测
１５］
，到［提示ｈＧＦＡＰ基因启动子在胚胎早期就已经
有活性。研究者将ｈＧｆａＣｒｅ转基因小鼠和Ｒｏ－ｐ
／ｓａ２６Ｒ转基因鼠杂交得到ｈＧｆａＣｒｅＲｏｓａ２６Ｒ基因ｐ型小鼠，通过Ｘａｌ染色并结合免疫组织化学染色－ｇ的方法检测小脑中表达β结果显示ａｌ的细胞类型，－ｇ除了Ｂｅｒｍａｎｎ胶质细胞和星形胶质细胞呈现Ｘ－ｇ
还有５ａｌ阳性染色外，０％颗粒细胞、３９％的浦肯野ｇ
细胞和６ａｌ染色阳５％少突胶质细胞也表现为Ｘ－ｇ
６］
；性［同时离体实验也证实ＧＦＡＰ阳性的细胞具有不仅能分化产生星形胶质细胞，神经干细胞的特性，
５］
。Ｃ／还可以产生神经元和少突胶质细胞［ｒｅｌｏｘｐ
条件性基因敲除技术克服了传统基因敲除的诸多弊端，是基因功能研究的最重要的技术之一。该技术需要制备两种遗传工程小鼠，一种是细胞种类特异性表达Ｃ另一种是目的基因片段ｒｅ的转基因小鼠，通过两种鼠系两侧带有ｌｏｘＰ位点的基因打靶小鼠，的杂交，可实现特定种类细胞靶基因特异性敲除。ＧＦＡＰ阳性细胞非专一性的分化方向提示我们这可能使得利用条件性基因敲除技术特异性敲除星形胶质细胞的靶基因受到质疑和挑战，最终的结果分析也会变得复杂。
研究中使用的ｈＧｆａＣｒｅＥＲＴ２转基因小鼠是ｐ时间特异性可诱导Ｃｒｅ重组酶表达的转基因小鼠。只有在外源性雌激素类似物如他莫昔芬的作用下才能诱导Ｃ因此可以选择不同ｒｅ重组酶基因的表达，时间点给他莫昔芬诱导Ｃｒｅ重组酶基因的表达。我们的研究结果表明Ｘａｌ阳性染色和星形胶质细胞－ｇ
第３期郭志宝等．他莫昔芬诱导的Ｃｒｅ重组酶在ｈＧｆａＣｒｅＥＲＴ２转基因鼠小脑中的表达研究ｐ
２３３
标记物Ｂ和神经元标记物Ｎｌｂｅ－ｐ能够很好共标记，浦肯野细胞标记物Ｃｕｎ、ａｌｂｉｎｄｉｎ以及少突胶质细
胞前体细胞标记物ＮＧ提示自胚胎晚期２不共标记，第１７．５天后用他莫昔芬诱导ｈＧｆａＣｒｅＥＲＴ２转基ｐ因鼠，Ｃｒｅ重组酶特异性在小脑星形胶质细胞中表不在神经元、浦肯野细胞、少突胶质细胞前体细达，
／胞中表达。这一结果为利用ＣｒｅＬｏｘｐ条件性基因敲除技术特异性敲除小脑星形胶质细胞的靶基因提供了可靠的理论依据。
参 考 文 献
［］ｅｎｅ１ＬｅｗａｎｄｏｓｋｉＭ．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｃｏｎｔｒｏｌｏｆｅｘｒｅｓｓｉｏｎｉｎ ｇｐ
，（）：ｍｏｕｓｅ．ＮａｔＲｅｖＧｅｎｅｔ２００１，２１０７４３７５５ｔｈｅ －［］／２ＣｌａｕｄｉｎｅＨＫ．ＣｒｅｌｏｘＰＳｓｔｅｍｆｏｒＧｅｎｅｒａｔｉｎＴｉｓｓｕｅ －ｙｇ
，ｓｅｃｉｆｉｃＫｎｏｃｋｏｕｔＭｏｕｓｅＭｏｄｅｌｓ．ＮｕｔｒｉｔｉｏｎＲｅｖｉｅｗｓ ｐ
（）：２００４，６２６２４３２４６－［］３ＥｎＬＦ，ＧｈｉｒｎｉｋａｒＲＳ，ＬｅｅＹＬ．ＧｌｉａｌＦｉｂｒｉｌｌａｒＡｃｉｄｉｃ ｇｙ
：（）ＰｒｏｔｅｉｎＧＦＡＰｈｉｒｔｎｅＹｅａｒｓ１９６９２０００ｅｕｒｏ－Ｔ－Ｏ－＊．Ｎ－ｙ，（）：ｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ２０００，２５９１０１４３９１４５１－－［，４］ＺｈｕｏＬ，ＴｈｅｉｓＭ，ＡｌｖａｒｅｚａａＩｅｔａｌ．ｈＧＦＡＰｃｒｅ －Ｍ －ｙ
ｔｒａｎｓｅｎｉｃｍｉｃｅｆｏｒｍａｎｉｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｄｎｅｕｒｏｎａｌｌｉａｌ ｇｐｇ，（）：ｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｖｉｖｏ．Ｇｅｎｅｓｉｓ２００１，３１２８５９４ －［ｌｉａ５］ＡｎｔｈｏｎＴＥ，ＫｌｅｉｎＣ，ＦｉｓｈｅｌｌＧ，ｅｔａｌ．Ｒａｄｉａｌ ｇｙ
ｓｅｒｖｅｓｒｏｅｎｉｔｏｒｓａｓｎｅｕｒｏｎａｌｉｎａｌｌｒｅｉｏｎｓｏｆｔｈｅｃｅｎ －ｐｇｇ，（）：ｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｓｔｅｍ．Ｎｅｕｒｏｎ２００４，４１６８８１８９０ －ｙ［］Ｃ６ａｓｅｒＫＢ，ＭｃＣａｒｔｈＫＤ．ＧＦＡＰｏｓｉｔｉｖｅｒｏｅｎｉｔｏｒ －ｐ ｐｙｐｇ
ｎｅｕｒｏｎｓａｎｄｏｌｉｏｄｅｎｄｒｏｃｔｅｓｔｈｒｏｕｈｏｕｔｃｅｌｌｓｒｏｄｕｃｅ ｇｙｇｐ，（）：ｔｈｅＣＮＳ．ＭｏｌＣｅｌｌＮｅｕｒｏｓｃｉ２００６，３１４６７６６８４ －［］Ｍ，７ｅｔｚｅｒＤ，ＣｌｉｆｆｏｒｄＪＣｈｉｂａＨ，ｅｔａｌ．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｓｉｔｅ ｇ
ｓｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓｕｓｉｎａｌｉ －ｐｇｇ ａｎｄｄｅｅｎｄｅｎｔｃｈｉｍｅｒｉｃＣｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．ＰｒｏｃＮａｔｌ－ ｐ（）：ＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９５，９２１５６９９１６９９５ －［８］ＳｏｒｉａｎｏＰ．ＧｅｎｅｒａｌｉｚｅｄｌａｃＺｅｘｒｅｓｓｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅＲＯ－ ｐ
，（）：ＳＡ２６Ｃｒｅｒｅｏｒｔｅｒｓｔｒａｉｎ．ＮａｔＧｅｎｅｔ１９９９，２１１７０７１ －ｐ［］ｏｓｔｎａｔａｌ９ＹｏｓｉｆＭＧ，ＪｏｈｎＳ，ＣｌｉｎｔｏｎＣ，ｅｔａｌ．Ｅａｒｌａｓ －ｐｙ
ｒｏｄｕｃｅｒｅｃｕｒｓｏｒｓｔｒｏｌｉａｌｃｅｌｌｓｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｅａｎｄｎｅｕｒａｌ ｐｐｇｇ，ｃｅｌｌｓｉｎｖｉｖｏ．ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２００６，２６ｓｔｅｍ （）：３３８６０９８６２１－［１０］ＭａｒｃＲＦ．Ｓｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｍｏｒｈｏｅｎｅｓｉｓｏｆａｓｔｒｏ －ｐｐｇ
，（）：ｃｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１０，３３０６００５７７４７７８－ｙ
［］Ｃ１１ｈｒｉｓｔｏｈｅｒｓｏｎＫＳ，ＵｌｌｉａｎＥＭ，ＳｔｏｋｅｓＣＣＡ，ｅｔａｌ． ｐ
Ｔｈｒｏｍｂｏｓｏｎｄｉｎｓａｒｅａｓｔｒｏｃｔｅｓｅｃｒｅｔｅｄｒｏｔｅｉｎｓｔｈａｔ － ｐｙｐ，：ｒｏｍｏｔｅＣＮＳｓｎａｔｏｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ２００５，１２０（３）４２１ －ｐｙｐｇ４３３
［］１２ＪｏｈｎｓｏｎＭＡ，ＷｅｉｃｋＪＰ，ＰｅａｒｃｅＲＡ，ｅｔａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
：ｄｅｖｅｌｏｍｅｎｔｆｒｏｍｈｕｍａｎｅｍｂｒｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｎｅｕｒａｌ ｐｙａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｓｎａｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｖｉａａｓｔｒｏｃｔｅｃｏｃｕｌｔｕｒｅ． ｙｐｙｙ ，（）：ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ２００７，２７１２３０６９３０７７ －［］Ｍ１３ａｈｅｓｈＶＢ，ＤｈａｎｄａａｎｉＫＭ，ＢｒａｎｎＤＷ．Ｒｏｌｅｏｆａｓ －ｐ
ｔｒｏｃｔｅｓｉｎｒｅｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｎｅｕｒｏｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕ －ｙｐｐ，（）：ｌａｒａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ２００６，２４６１２１９ －－ｇｙ［］Ｆ１４ｅｎＬ，ＨａｔｔｅｎＭＥ，ＨｅｉｎｔｚＮ．Ｂｒａｉｎｌｉｉｄｂｉｎｄｉｎ －ｇｐｇ
：ｒｏｔｅｉｎ（ＢＬＢＰ）ａｎｏｖｅｌｓｉｎａｌｉｎｓｓｔｅｍｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌ －ｐｇｇｙ ，（）：ｏｉｎｍａｍｍａｌｉａｎＣＮＳ．Ｎｅｕｒｏｎ１９９４，１２４８９５９０８ －ｐｇ ［］１５ＢａｅｎａｒｕＭＬ，ＺｈｕＹ，ＨｅｄｒｉｃｋＮＭ，ｅｔａｌ．Ａｓｔｒｏｃｔｅ －ｊｙ
ｓｅｃｉｆｉｃｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｎｅｕｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ１ｇｅｎｅ ｐ
（ＮＦ１）ｉｓｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｆｏｒａｓｔｒｏｃｔｏｍａｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ ｙ，（）：Ｂｉｏｌ２００２，２２１４５１００５１１３Ｃｅｌｌ －２３４
图 版 说 明
中国组织化学与细胞化学杂志
第２１卷
），２００ｍ（ｔｈｅｗｈｏｌｅｆｉｕｒｅ８０ｍ（ｌｏｗｅｒｒｉｈｔｂｏｘ）． ｇｇμμＦｉｕｒｅＢ：Ｐ１４ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ．Ｂａｒ＝３００ｍ（ｔｈｅｗｈｏｌｅ ｇμ），１２０ｍ（ｌｏｗｅｒｒｉｈｔｂｏｘ）．ＦｉｕｒｅＣ：Ｐ６０ｆｉｕｒｅ ｇｇｇμ），ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ．Ｂａｒ＝３００ｍ（ｔｈｅｗｈｏｌｅｆｉｕｒｅ１２０ｍ ｇμμ（）；ｌｏｗｅｒｒｉｈｔｂｏｘ．ＩＧＬ：ｉｎｔｅｒｎａｌｃｅｌｌＥＧＬ：ｒａｎｕｌａｒ ｇｇｅｘｔｅｒｎａｌｒａｎｕｌａｒｃｅｌｌ ｇ
ａｌｓｔａｉｎｉｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＸｓｔａｉｎｉｎａｎｄｉｍｍｕＦｉ．２Ｄｏｕｂｌｅ － －ｇｇｇｇ
ｎｏｓｔａｉｎｉｎｉｎＰ７ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ．ＦｉｕｒｅＤ－Ｈｒｅｒｅｓｅｎｔｓ ｇｇｐ ，Ｎ，ａｌｓｔａｉｎｉｎｏｆＸｓｔａｉｎｉｎｗｉｔｈＢｌｂｅｕｎｄｏｕｂｌｅ － ｇｇｇｐ ，ＣａｌｂｉｎｄｉｎＢｌｂａｎｄＮｅｕｎｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ．Ｔｈｅａｒｒｏｗｉｎ －ｐｐｙ ｄｉｃａｔｅｓｃｅｌｌｓｃｏｅｘｒｅｓｓｉｎｂｌｂａｎｄｘｍａｌ．Ｂａｒ＝１０ －ｐｇｐｇ μｓｔａｉｎｉｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＸｓｔａｉｎｉｎａｎｄｉｍｍｕＦｉ．３Ｄｏｕｂｌｅａｌ － －ｇｇｇｇ
ｎｏｓｔａｉｎｉｎｉｎＰ１４ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ．ＦｉｕｒｅＩｒｅｒｅｓｅｎｔｓ －Ｋ ｇｇｐ ，ｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎｏｆＸａｌｓｔａｉｎｉｎｗｉｔｈＢｌｂＢｌｂａｎｄ － ｇｇｇｐｐ Ｃａｌｂｉｎｄｉｎｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ．Ａｓｔｅｒｉｓｋｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｂｏｄｉｅｓｏｆ ｐｙＰｕｒｋｉｎｅｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅａｒｒｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｃｅｌｌｓｃｏｅｘ －ｊ，，ｒｅｓｓｉｎａｌ．Ｂａｒ＝１５ｂｌｂａｎｄｘｍ（ｆｉｕｒｅＩＫ）７． － ｐｇｇｐｇ μ）ｍ（ｆｉｕｒｅＪ５ ｇμ
ａｌＦｉ．４ＤｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＸｓｔａｉｎｉｎａｎｄＮｅｕｎｉｍ－ － ｇｇｇｇ
ｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｉｎＰ１４ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ．Ｔｈｅａｒｒｏｗｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｇ ，ｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓＢａｒ＝１５ｍ（ｆｉｕｒｅＬ）７．５ｍ（ｆｉｎｅｕｎ－ｐ －ｇｇμμ
ｕｒｅＭ） Ｆｉ．５ＤｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆＸａｌｓｔａｉｎｉｎａｎｄｉｍｍｕ － －ｇｇｇｇ
ｎｏｓｔａｉｎｉｎｉｎＰ６０ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ．ＦｉｕｒｅＮ－Ｓｒｅｒｅｓｅｎｔｓ ｇｇｐ ，Ｎ，ｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎｏｆＸｓｔａｉｎｉｎｗｉｔｈＢｌｂｅｕｎａｌ － ｇｇｐｇ ，ＮＧ２，ＣａｌｂｂｉｎｄｉｎＮｕｅｎａｎｄＮＧ２ｒｅｓｅｃｔｉｖｅｌ．Ａｓｔｅｒ －ｐｙ，ｉｓｋｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｂｏｄｉｅｓｏｆＰｕｒｋｉｎｅｃｅｌｌｓｔｈｅａｒｒｏｗｉｎ －ｊｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｃｅｌｌｓｃｏｅｘｒｅｓｓｉｎｂｌｂａｎｄｘａｌｉｎｆｉｕｒｅ － ｐｇｐｇｇ Ｎ，ｏｔｈｅｒａｒｒｏｗｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈｅｃｅｌｌｓｎｏｔｃｏｅｘｒｅｓｓｉｎｘ －ｐｇ ａｌａｎｄｔｈｅａｎｔｉｅｎｉｎｆｉｕｒｅＯ，Ｐ，Ｒ，Ｓ．Ｂａｒ＝７．５ｍ ｇｇｇμ（），ｆｉｕｒｅＮ－Ｏ，ＲＳ１５ｍ（ｆｉｕｒｅＰ － －Ｑ）ｇｇμ
图１ 不同时间点Ｘａｌ阳性细胞分布特征Ａ图：Ｐ７小脑－ｇ
；标尺：整图＝２右下框＝８Ｘａｌ染色（００ｍ，０ｍ）Ｂ－ｇμμ图：标尺：整图＝３右下框Ｐ１４小脑Ｘ００ｍ，ａｌ染色（－ｇμ；Ｃ图：标尺：整图＝ａｌ染色（＝１２０ｍ）Ｐ６０小脑Ｘ－ｇμ。右下框＝１内颗粒细胞层；３００ｍ，２０ｍ）ＩＧＬ：ＥＧＬ：μμ外颗粒细胞层
图２ Ｐ７小脑切片Ｘａｌ和免疫组织化学染色双重标记Ｄ－－ｇ
，，，，Ｈ图依次为Ｘａｌ和ＢｌｂＮｅｕｎＣａｌｂｉｎｄｉｎＢｌｂＮｅ－－ｇｐｐｕｎ免疫组织化学染色双重标记。图中箭头指示Ｘａｌ－ｇ和ｂｌｂ０ｍｐ阳性的细胞。标尺＝１μ
图３ Ｐａｌ和免疫组织化学染色双重标记Ｉ１４小脑切片Ｘ－－ｇ
，，ａｌ和ＢＫ图依次为ＸｌｂＢｌｂＣａｌｂｉｎｄｉｎ免疫组织－ｇｐｐ化学染色双重标记。图中星号指示浦肯野细胞胞体所在位置，箭头指示Ｘａｌ和ｂｌｂ－ｇｐ阳性的细胞。标尺、，）＝１５ｍ（ＩＫ）７．５ｍ（Ｊμμ
图４ Ｐ１４小脑切片Ｘｅｕｎ免疫组织化学染色双重ａｌ和Ｎ－ｇ
标记图中箭头指示ｎ外颗粒细ｅｕｎ阳性的细胞，ＥＧＬ：，胞层。标尺＝１５ｍ（Ｌ）７．５ｍ（Ｍ）μμ
图５ Ｐａｌ和免疫组织化学染色双重标记６０小脑切片Ｘ－ｇ
，，ａｌ染色和ＢＮ－Ｓ图依次为ＸｌｂＮｅｕｎＮＧ２，Ｃａｌｂ－－ｇｐ，，ｂｉｎｄｉｎＮｕｅｎＮＧ２免疫组织化学染色双重标记。图中星号指示浦肯野细胞胞体所在位置，箭头（指Ｎ图）示Ｘ箭头（指示ｌｂＯ－Ｐ，ＲＳ图）ａｌ和ｂ－－ｐ阳性的细胞，ｇＸａｌ和相应抗体不共表达的细胞。标尺＝７．５ｍ－ｇμ（），Ｎ－Ｏ、ＲＳ１５ｍ（Ｐ－－Ｑ）μ
ＥＸＰＬＡＮＡＴＩＯＮＯＦＦＩＧＵＲＥＳ
Ｆｉ．１ＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆＸｓｔａｉｎｉｎｃｅｌｌｓａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｌｏｓｉｔｉｖｅ － ｇｇｇｐ
ｓｔａｅｓｉｎｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ．ＦｉｕｒｅＡ：Ｐ７ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ．Ｂａｒ＝ ｇｇ
第３期郭志宝等．他莫昔芬诱导的Ｃｒｅ重组酶在ｈＧｆａＣｒｅＥＲＴ２转基因鼠小脑中的表达研究ｐ
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