30多种PCR技术简单描述(2)

2018-12-19 21:47

菌落PCR,通过PCR手段来迅速筛选阳性克隆子。使用灭菌的牙签将菌落直接挑到反应混合液中,通过PCR预变性步骤的高温使细菌的基因组释放作为PCR反应的模板。菌落PCR中使用的引物定位在插入位点外侧的载体区,因此尽管插入的序列各不相同,也不影响扩增反应的进行。

26、RACE-PCR(rapid amplification of cDNA ends):

一种RT-PCR方法,当对DNA序列信息了解较少时,使用单个特异性引物加一个接头引物来扩增cDNA的5'端(对应转录的起始位点)或3'端从而产生新的cDNA,重叠的RACE产物可结合起来产生全长的cDNA片段。

27、DD-PCR (differential display):

差异显示技术,用来鉴定不同组织中差异表达的基因。将不同组织的RT-PCR产物用短的、非特异性引物进行扩增,然后在凝胶上比对来源于不同组织的条带,只在某种组织中才出现的条带被认为是差异表达的。

28、AFLP(Amplified fragment length polymorphism):

扩增片段长度多态性,通过扩增使不同生物基因组呈现不同长度的片段。

29、AP-PCR (arbitrary primed)/RAPD (random amplified polymorphic DNA): 随机扩增多态性DNA,使用随机寡核苷酸片段来扩增序列未知的靶基因,形成基因组指纹图谱,用来分析物种的相关性。

30、Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR:

可变数目串联重复序列PCR,使引物定位在具有长度多态性的靶基因区,通过在凝胶电泳后对产物的大小进行分析来研究基因分型。

31、Inverse PCR:

反向PCR,允许扩增已知序列侧翼的DNA区。首先将靶DNA用限制性内切酶进行多轮消化,然后连接被消化的片段构建环状的分子,引物设计成可从序列已知的区域向外侧延伸,结果扩增出环状分子上剩余的序列。

32、Real-Time PCR:

实时PCR,由于通常的PCR在几十个循环后都会进入平台期,产物的量与初始模板量不在成正比,因此只能用来定性。而实时PCR通过使用荧光染料,例如SYBR Green或荧光标记探针,例如TaqMan可用来检测随着扩增的进行,产物量的变化而进行定量。

33、原位PCR

原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术,使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞(爬片、甩片或涂片)或组织(石蜡、冰冻切片)上直接对靶基因片段进行扩增,通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。

34、PCR-SSCP

1989年日本Orita等创建的筛查突变的新技术。它是一种简单、快速、经济的点突变筛查手段。PCR-SSCP技术的基本原理是PCR扩增后的DNA片段经变性成单链DNA,单链DNA在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时形成不同的立体构象,其构象直接影响泳动速率,相同长度的 DNA单链其核苷酸顺序仅有单个碱基的差别,就可以产生立体构象的不同,造成泳动速率的不同,产生不同的泳动带。

PCR扩增后的DNA片段经变性成单链后在不含有变性剂的中性胶中电泳,与正常比较出现泳动带的变位即可推测存在碱基置换。其碱基置换的性质必须经过DNA测序才能确定。因此PCR-SSCP检测是测序之前突变筛查的常用手段。为了便于观察分析结果,PCR扩增体系中常加入a-32P dNTP标记PCR产物,电泳后放射自显影观察泳动带的位置。目前也常用银染法来染色聚丙烯酰胺凝胶上的DNA泳动带,此方法可避免同位素的污染及对操作者的辐射损伤,但其灵敏度不如用同位素标记。单链DNA片段的立体构象主要与碱基序列相关,但也受到其他条件的影响。因此,PCR-SSCP技术的关键在于电泳时的诸多条件,如凝胶的组成、电泳的温度、离子浓度以及影响分子内相互作用的其他溶质等。PCR-SSCP的缺点是存在假阴性和假阳性,一般对长度不超过300bp的待测片段的检出率为70~80%。


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