紫外诱变吸水链霉菌选育高产农用抗生素菌株
黄永春 曹仁林 彭祎
（农业部环境保护科研监测所，天津，300191）
摘 要：从海南土壤中筛选出一株吸水链霉菌.研究发现，其最佳摇瓶发酵温度为28℃，pH为5.5，最佳发酵时间为96h。第一次紫外线诱变后得到8株正变菌株，经过斜面上连续5次传代后发现1-29较稳定，将其作为第二次诱变的出发菌株，得到13株正变菌株，经连续5次传代后筛选出3株较为稳定的菌株。经过连续两次紫外诱变，菌株的产素能力提高20%以上。
关键词：链霉菌, 农用抗生素, 紫外诱变, 发酵.
由于化学农药的大量使用，抗药性害虫的种类不断增加，为达到预期防治效果化学农药的用量也相应不断提高，由此直接导致农产品中化学农药残留量的增加，严重污染了环境，危害人类健康。农用抗生素作为一类生物农药，它具有使用剂量低，环境相容性好，选择性强的特点[1]，因此受到普遍关注。
目前发现的天然抗生素有约三分之二来源于链霉菌。我们从海南岛土壤中筛选出一株抗生素产生菌，经鉴定为吸水链霉菌(streptomyces hygroscopicus)，发现其发酵液中次级代谢产物对常见作物病害如白粉病、灰霉病、褐霉病等都具有较好的防治效果[3]，但此产生菌的原始菌株效价较低，本文通过紫外诱变法进一步提高其产毒能力。
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1 材料与方法
1.1 菌种
以吸水链霉菌海南变种S101菌株经自然分离后获得的S510菌株为出发菌株。指示菌为小麦赤霉菌（本试验室收藏）。 1.2 培养基
斜面、平板培养基：可溶性淀粉15g；酵母膏4g；K2HPO41g；MgSO4·7H2O1.5g；复合维生素片：1/4片；葡萄糖2.5g；蛋白胨2.0g；玉米浆：14mL；麦芽膏2.5g，加水至1L，调节pH=6.5。
发酵培养基：可溶性淀粉15g；酵母膏4g；K2HPO41g；MgSO4·7H2O1.5g；复合维生素片：1/4片；葡萄糖2.5g；蛋白胨2.0g；玉米浆：14mL；麦芽膏2.5g，加水至1L，调节pH=6.0。 土豆培养基：土豆去皮后切碎，称取400g，放入锅中加入自来水，煮沸1h，经双层纱布过滤后收集土豆汁2000mL，向其中加入葡萄糖40g,琼脂粉40g，加热溶化后分装于三角瓶中，121℃灭菌20min后备用。 1.3 孢子悬液的制备
将成熟孢子斜面加入无菌水，洗下孢子，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，于28℃、200r/min振荡25-30min，使孢子分散活化，经灭菌漏斗过滤，制得单孢子悬液，用血球计数板计数，控制孢子浓度为106个/ml，备用。
1.4 紫外诱变
吸取10ml上述孢子液于直径9cm的无菌培养皿中，磁力搅拌，紫外照射（功率30W，距离30cm）2min。照射后立即避光保存，备用。并同时取未经紫外照射的孢子悬液作CK。 1.5 初筛
采用琼脂块法[4]，对诱变株进行初筛。吸取200μl经诱变的孢子悬液涂布于平板培养
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基上，28℃条件下培养5d，待单菌落长出后，用直径5mm 的打孔器打孔后，移种于涂布有小麦赤霉菌孢子的土豆培养基上，24℃倒置培养48h，测量抑菌圈大小。挑选抑菌圈较大的菌落转接于斜面培养基上。待斜面完全被孢子覆盖后，置于4℃冰箱保存。 1.6 复筛
采用二级摇瓶复筛法，即将培养好的斜面菌种挖块接种于装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶，28℃，240r/min振荡培养24h。吸取15ml种子培养液转接入含有80ml发酵培养基的500ml三角瓶中。28℃，240r/min振荡培养96h。
1.7 发酵液效价测定
取发酵液0.3ml于经灭菌后的直径9cm培养皿中，向其中加入14.7ml的土豆培养基稀释50倍，混匀。用直径5mm打孔器对生长满赤霉菌丝的土豆培养基打孔，并将菌丝面朝下接种于混有发酵液的培养基上。并同时向未添加发酵液的15ml土豆培养基上接种小麦赤霉菌琼脂块作阴性对照，每个样品重复3次，24℃倒置培养72h，测量菌斑直径，按如下公式计算抑制率。a=测定直径(mm)-5, b=阴性对照测定直径(mm)- 5,抑制率=（b-a）/b×100% 。
2. 结果与讨论
2.1 发酵培养基pH值对发酵液效价的影响
培养基的pH是摇瓶发酵条件的重要技术指标，为了找到最适的发酵pH范围，本试验对pH=4.5～7.5的范围进行了考察。分别用盐酸和氢氧化钠在酸度计的监控下将发酵培养基的pH调解到所需值，每个pH值重复4次，于28℃下摇瓶发酵培养96h，并进行效价测定，结果如图1所示。
抑制率100?`@ %0D.555.566.577.5pH值图1 不同pH对效价的影响Figure1 The affection of different pH to theproduction of antibiotic结果发现，在pH介于5.5～6.5范围内时，发酵液的效价值最高。当pH=6时发酵液的效价最高，可达到完全抑制，故选用pH=6.0作为发酵培养基的最适pH值。
2.2 发酵培养时间对发酵液效价的影响
抗生素的生物合成通常在营养生长和形态分化间的过渡期内进行。为确定在本试验发酵条件下菌株的最佳产素时期，采用间隔取样并测定发酵液效价的方法考察了发酵24h～96h时段内菌株的产素情况，如图2所示。
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抑制率100?`@ %0$487296时间（h)图2 发酵时间对效价的影响Figure2 The affection of fermation time to the production ofantibiotics
由图2可见，发酵24h时发酵液对指示菌的抑制率不足10%，但随着时间的延长抑制率迅速增加，72小时以后发酵液的效价可维持在一个较稳定的范围内，本试验选用96h作为发酵时间。
2.3 高产菌株的选育 本试验对所筛选出的吸水链霉菌进行了连续两次紫外诱变。第一次以原始出发菌株（S510）为诱变对象，经紫外诱变涂板和初筛后，从平板中挑选抑菌圈较大的55株菌株进行摇瓶发酵复筛并经过生测后以出发菌株对指示菌的抑制率为参照，发现有8株正变菌株，结果见表1。
表1 第一次诱变得到的正变菌株
Table1 The positive strains of the first UV mutagenesis
编号 抑制率(%) 提高率（%） S510 75.01 —— 1-3 79.08 5.15 1-7 79.33 5.45 1-21 82.43 9.0 1-24 78.24 4.13 1-29 81.59 8.06 1-38 79.08 5.15 1-54 76.57 2.04 1-55 78.24 4.13 将筛选出的正变菌株进行斜面传代培养，连续传代5次，仍采用摇瓶复筛法进行筛查，发现与初始菌株相比1-29号菌株仍能保持较高的抑制率，效价未见明显下降稳定性较好，故选用1-29号菌株作为第二次诱变的出发菌株。
在以1-29为出发菌株的第二次诱变过程中，经紫外诱变涂板和初筛后，从平板中挑选抑菌圈较大的65株菌株进行摇瓶发酵复筛。经生测后以出发菌株的抑制率为参照，发现有13株正变菌株，结果见表2。
表2 第二次诱变得到的正变菌株
Table2 The positive strains of the second UV mutagenesis
编号 1-29 2-1 98.96 2-2 90.63 2-4 85.42 2-11 96.18 2-16 87.85 2-27 82.64 2-29 92.01 2-30 93.06 2-35 95.49 2-37 97.22 2-39 98.61 2-40 2-46 97.92 87.50 抑制率(%) 81.59 提高率 （%） —— 17.55 9.97 4.48 15.17 7.13 1.27 11.32 12.33 14.56 16.08 17.26 16.68 6.75 3
将得到的正变菌株继续在斜面上连续传代5次，采用摇瓶发酵法进行筛查，发现2-1,2-37、和2-40号菌株传代稳定，具有较好的稳定性。
经连续两次紫外诱变发现，较初始菌株其产素能力提高大于24.14%，说明采用紫外诱变法是一种较为有效的诱变措施。
3. 结论
紫外诱变法是抗生素菌种选育中一种常用手段。由于该法操作简单、危险性小所以应用较为广泛。本试验采用此法使菌株的抗生素生产能力提高20%以上，斜面上连续传代5次发现遗传性状较为稳定。紫外诱变法还是一种随机性较强的诱变方法，需要进行大量筛选方能筛选出正变率较高大的菌株。本文采用琼脂块法极大简化了筛选步骤，有利于提高筛选效率。
发酵条件直接影响到菌种的产素能力。本文对摇瓶发酵的最佳pH值及发酵时间都作了探讨，并筛选出了最佳条件。根据菌种鉴定结果提供的菌株最适生长温度为28℃，本文直接采用此温度作为发酵最适温度。
本文未涉及到发酵液中抗生素的分离纯化及化学结构问题，将在其它文章中专门介绍。
参考文献
1. 唐伟,孙军德,张翠霞. 农用抗生素产生菌菌种选育的研究进展,微生物学杂志, 2004,24(4):42-45.
2. Richard H. Baltz. Genetic manipulation of antibiotic-producing Streptomyces.Trends in microbiology, 1998,2,76-83.
3. 黄永春,曹仁林，彭祎. 吸水链霉菌田间药效试验研究.农业环境与发展,待发. 4.祖若夫，胡宝龙，周德庆．微生物实验教程[M]．上海：复旦大学出版社，1993．
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Breeding of Agricultural Antibiotic High-producing Streptomyces
hygroscopicus Strain by Ultraviolet Mutagenesis
HUANG Yong-chun CAO Ren-lin PENG yi
( Agro-Environmental protection and Research Institute of MOA, Tianjin,300191,China)
ABSTRACT
A Streptomyces hygroscopicus strain was screened from soil of Hainan province, china. In the shaking flask, the most moderate temperature , pH and fermentation time was 28 ℃, 5.5 and 96 hours respectively. As an original strain, the antibiotic producing strain S510 was treated by ultraviolet (UV) mutagenesis and a stable mutant 1-29 was obtained. Take 1-29 as parent strain, the second ultraviolet mutagenesis was taken on and 13 strains were obtained. Submerged culture showed that the hereditary character of high-producing was table. After two times UV mutagenesis the productivity of mutant strains were 20% higher than that of the original one.
Key words: streptomyces, agricultural-antibiotic, ultraviolet mutagenesis
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