实验1 气相色谱法测定药物中的有机溶剂残留量
一 实验要求
1、掌握内标法、外标法计算杂质含量。
2、熟悉气相色谱-氢火焰离子化检测器法（GC-FID）测定原料药中残留有机溶剂的方法。 3、熟悉气相色谱仪的工作原理和操作方法。
二 实验指导要点:
1. 气相色谱仪的工作原理，填充柱、毛细管柱的性能（固定相极性，最高使用温度，色谱柱长、内径大小，固定液涂渍百分含量等）介绍。
2. 通气、开、关机顺序，气路密封性检查（开机加热前用洗洁精水稀释液或中性肥皂水检漏。必要时进行此项检查。），升温预热仪器。
3. 气化室、柱温、检测室温度设定和载气、氢气、空气流速控制的一般要求。 4. 色谱软件使用介绍。
5. 待基线稳定，进样分析。进针和拔针速度要求快而果断，并留针一定时间，每次进、拔针速度、留针时间应保持一致（示范）。
6. 记录样品名，色谱图文件号，保留时间，峰面积（或峰高）。 7. 按要求计算柱效、分离度、拖尾因子和重复性。 8. 校正因子计算，内标法、外标法计算杂质含量。
9. 药品或其制剂在该色谱条件下不出峰，若样品无法获得，可准备一个含一定量（根据限量要求）丙酮的水溶液作为样品液，供学生实验用。
三 主要仪器与药品
气相色谱仪，弱极性或中等极性气相色谱柱，1～5μL微量注射器；无水乙醇、乙酸乙酯和乙酸丁酯（均为分析纯）。
四 实验流程和步骤（含操作要点） 1、色谱条件
色谱柱：TM-plot Q毛细管柱，柱长15 m，内径0.53 mm。检测器：FID。柱温：140℃保持2min，35℃/min升高到200℃，保持1min；气化室温度：200℃，检测器温度：230℃，载气：氮气：0.1MPa，空气：0.15 MPa，H2：0.1 MPa，进样：0.2 μL。
2、溶液制备与测定
精密量取乙酸丁酯适量，置10mL量瓶中，精密加乙酸乙酯（内标物质）溶液5 mL，加
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乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；另取量取乙酸丁酯适量，置10mL量瓶中，精密加入上述内标溶液5 mL，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。取上述溶液，按照气相色谱法，按乙酸丁酯计算的理论板数应大于700。 3、计算
按下式计算定量校正因子（f）和样品中乙酸丁酯(BA)的含量（g/ml）： 内标为乙酸乙酯（EA），定量方法采用峰高。
已知标准品溶液中BA的浓度为0.25×10-3g/ml，请用内标法求样品中BA的浓度。 内标物EA在标准品和样品中的浓度相同，配置过程相同。
A 为峰面积或峰高，G为浓度含量（g/ml）。
五 注意事项
人身安全，仪器安全；
器皿和药品轻拿轻放，如不清楚使用方法，可以请教老师； 实验结束后打扫实验台面和地面。 关于气相色谱仪器的注意事项：
1、色谱柱的使用温度——各种固定相均有最高使用温度的限制，为延长色谱柱的使用寿命，在分离度达到要求的情况下尽可能选择低的柱温。开机时，要先通载气，再升高气化室、检测室温度和分析柱温度，为使检测室温度始终高于分析柱温度，可先加热检测室，待检测室温度升至近设定温度时再升高分析柱温度；关机前须先降温，待柱温降至50℃以下时，才可停止通载气、关机。
2、进样操作——为获得较好的精密度和色谱峰形状，进样时速度要快而果断，并且每次进样速度、留针时间应保持一致。
3、检测器的使用——为避免被测物冷凝在检测器上而污染检测器，检测器的温度必须高于柱温30℃，并不得低于100℃。FID点火时应关小空气流量和开大H2流量，待点燃后，慢慢调整到工作比例。用峰高定量时，需保持载气流速恒定。
六 作业和思考题
1 利用气相色谱法的结果测定，使用内标法计算样品中有机溶剂残留的浓度。 2 根据实验结果计算乙酸丁酯的系统适用性参数，并根据上述参数判断实验结果好坏。
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七 附录
1、对仪器的一般要求
通常所用载气为氮气；色谱柱为填充柱或毛细管柱，常用玻璃或弹性石英毛细管柱的内径为0.20 mm或0.32 mm。进样口温度应高于柱温30～50 ℃；进样量一般不超过数微升；柱径越细进样量应越少。检测器为氢火焰离子化检测器，检测温度一般高于柱温，并不得低于100 ℃，以避免水汽凝结，通常为250～350 ℃。
药典各品种项下规定的条件，除检测器种类、固定液品种及特殊指定的色谱柱材料不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体牌号、粒度、固定液涂布浓度、载气流速、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并符合系统适用性试验的要求。一般色谱图约于30分钟内记录完毕。 2、系统适用性试验
试验目的：用规定的对照品对仪器进行试验和调整，分析测试色谱柱的理论板数、分离度、重复性和拖尾因子，以达到规定的要求，保证分析的精确性。
测试内容与方法：
(1)、色谱柱的理论板数（n）:在选定的条件下，注入各品种项下规定的供试品溶液或内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间（tR）和半峰高宽（Wh/2），按n=5.54(tR/Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于规定的理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
注意：测得的各项参数可以采用时间或长度计，但必须取相同单位。
(2)、分离度:要求被测物色谱峰与其他峰或内标峰之间的分离度应大于1.5或各品种项下规定的值。分离度（R）的计算公式见课本。
(3)、进样重复性:取对照溶液，连续进样5次，其峰面积测量值的相对标准偏差应小于2.0%。也可按校正因子测定项下，配制相当于80 %、100 %和120 %的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应小于2.0 %
(4)、拖尾因子 取对照溶液或样品溶液进样，记录色谱图，计算拖尾因子（T），要求T在0.95~1.05之间。 3、测定法
定量测定时，可根据供试品的具体情况采用峰面积法或峰高法。测定杂质含量时，须采用峰面积法。
（1）内标法加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量：
1)、校正因子测定：精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶
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液适量，混合，配成校正因子测定液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高。
2)、样品测定：精密称（量）取样品适量，配成溶液。精密量取样品溶液与内标溶液适量，混合，配成样品测定液。取一定量注入色谱仪，记录色谱图。测量供试品溶液中待测成分（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高。
当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液使用同一份内标物质溶液时，则配制内标物质溶液不必精密称（量）取。 (2)、外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量
精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高）。
注意事项：气相色谱法为手工进样，进样量不易精确控制，应特别注意留针时间和室温的影响。
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