人IL-5 人IL-6 人IL-10 人IL-12 人IL-15 人Fractalkine/CX3CL1 人IL-8/CXCL8 人MCP-1/CCL2 人MIP-1a/CCL3 人MIP-1b/CCL4 人RANTES/CCL5 小鼠IL-2 小鼠IL-4 小鼠IL-5 小鼠IL-6 小鼠IFN? 小鼠TNF-? 方法1 单核细胞：方法3 (6-12 小时) T细胞：方法6 方法1 方法8 方法3 方法1 方法3 (24 小时) 方法3 (24 小时) 方法3 (24 小时) 方法3 (24 小时) 方法1 方法9 方法10 方法10 方法11 方法9 or 方法12 方法9 为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后4-6个小时，需要使用蛋白转运抑制剂 (如3uM monensin，10mg/ml的BFA)
方法1: 只使用转染细胞检测
方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时.
方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时.
方法4: 人的PBMCs或者纯化的CD4＋细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有重组人的IL-2（10 ng/ml，目录号202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目录号204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时 方法5: CD4+ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 days
方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1b (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)
方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激
方法8: PBMCs细胞使用重组人IFN? (10 ng/ml，目录号285-IF-100) 刺激2 小时，然后使用IFN? (10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞.
方法9: EL4 在包被抗小鼠CD3抗体(25 ug/ml) 的培养板中，使用抗CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激6小时
方法10: CD4＋T细胞在包被小鼠CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的CD28(2 ug/ml)的抗体，重组小鼠的IL-2（10 ng/ml，目录号402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目录号404-ML-005）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠IL-2和IL-4的培养基中继续培养3天；最后收获细胞，使用PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和monensin刺激6小时。
方法11: 小鼠ip巨噬细胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小时
方法12: 小鼠脾细胞使用PMA (5 ng/ml)和Ionomycin (500 ng/ml)刺激6小时
六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）
1、收获细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按1：1与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37℃，5%二氧化碳培养4-6小时
2、阻断Fc受体：用于消除非特异性的结合染色
① 在小鼠，可使用纯化的FcII/III受体的抗体（CD16/32），按照1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4℃孵育15分钟，PBS清洗后，直接进行下一步染色。
②对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型不相关的纯化Ig或者血清进行阻断
3、细胞表面染色
① 加适当的细胞表面染色试剂20?L于Falcon管中，加入100?L激活后的全血 (细胞浓度维持在2×106/mL) 混匀，室温暗处孵育15分钟；
② 加入溶血素，室温暗处孵育10分钟。（注意：PMA激活的全血可能会溶血不完全。）
③离心500g 5分钟，弃上清
4、固定和破膜
① 加固定剂，室温暗处孵育15分钟，离心500g 5分钟，弃上清；
② 加破膜剂温暗处孵育10分钟。（剂量参照说明书）
③ 加2?3mLPBS洗液，离心500g 5分钟，弃上清。
5、细胞内染色
① 加入荧光标记的细胞因子抗体，混匀，室温暗处孵育30分钟。
② 加2?3mL洗液，离心500g 5分钟，弃上清，加入500?LPBS上机或加入500?L 1% PFA固定后再上机
七、注意事项
1. 标本处理：避免使用络合钙的抗凝剂，如ACD与EDTA，因为它们会限制钙依赖性激活过程，推荐用肝素钠。此外LPS，一种常见的生物试剂污染物，是强细胞激活剂，可能会混淆试验结果。血样在8小时内分析，超过8小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少5%。如不能在8小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。
2.刺激激活：检测不同的细胞因子根据情况选择不同的刺激剂组合和刺激时间，以保证最佳的检测效果。比如，要检测IFN-γ则可选择PMA和Ionomycin同时刺激；如果用CD4做表面标记，由于多数病人的CD4抗原会因PMA的激活而有不同程度的下调，所以培养时间不能太长，4-6小时为宜，否则CD4下调影响分析
3.选择合适的对照：为保证结合的真是和可靠性，至少荧光设置以下对照：
①未刺激对照：激活时由于BFA的存在抑制了胞内蛋白的转运，因此在激活过程中产生 的抗原与细胞因子会滞留胞内，未刺激对照也应包含BFA。
② 激活对照：激活对照使用细胞表面表达CD69来评价激活与否，如果未达到CD69期望的水平，则激活步骤出了问题，某一试剂可能失活，过期，制备不当或溶剂污染，需制备新鲜刺激剂重新实验。
③同型对照：使用与荧光标记抗体相同来源、相同标记、相同剂量和亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。
4. Fc受体阻断：使用试剂阻断Fc受体可以有效减少非特异荧光染色，在小鼠可以用纯化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience, 目录号14-0161-81），在大鼠可以用纯化的抗大鼠的CD32，在人可以用过量的同种无关纯化Ig或血清。
5. 荧光素的选择：检测相对低表达细胞因子如IL-4时，应选用PE或APC标记；单检测某一细胞因子时最好也选用PE或APC标记；同时检测多种细胞因子时，弱表达的应选用PE或APC，FITC标记最好用于高表达细胞因子如IFN-γ
八、问题与解答
问题 原因 解决 激活剂制备不当，见激活剂制备储存一节。 应使用肝素钠，不要使用无CD69胞内染色 细胞未通透 使用了错误的抗凝剂 肝素锂，避免使用ACD与注释 PMA+Ionomycin激活4小时后CD3+T淋巴细胞CD69阳性率应>90% 淋巴细胞激活需要Ca，络合Ca的抗凝剂会影响激活。 细胞未激活 EDTA等络合钙的抗凝剂。 在使用通透液前先使用溶血素 详见BFA制备BFA于-20℃储存 按R&D推荐量使用荧光抗体 按操作程序通透后洗细溶血素辅助细胞通透 BFA失活或制备不当 详见BFA制备 正常的激活T淋巴细胞IL-4表达通常<2%，应使用PE或APC标记 胞内染色阳性但很弱 抗细胞因子抗体浓度不对 通透后细胞在胞内染色前未洗 荧光单抗不纯或荧光与抗体结合不牢导致解析出的荧光染料非特异结合 背景染色太高 抗体与固定后的胞内抗原亲和力低，需提高抗体浓度。 胞再胞内染色 使用试剂阻断Fc受体可以有效使用R&D 试剂 减少非特异荧光染色，详见Fc段受体阻断节 使用R&D试剂并按推荐剂量 错误的同型对照，对照Ig浓按R&D推荐量使用R&D匹度过高 严重的细胞损失 溶血不完全 洗涤离心步骤丢失细胞 加样步骤丢失细胞 PMA+Ionomycin激活 溶血未在室温进行 配的同型对照试剂 固定通透的细胞离心500g 弃上清带走细胞 固定后细胞密度低于活细胞，需用高转速离心。 小心吸样 按操作步骤用FL3做阈PMA可稳定红细胞膜，PMA+I激值去除碎片和未溶细胞 在室温进行溶血 活全血较难溶 Th1/Th2细胞研究方法
尽管目前提出了较多的 Th1/Th2细胞表面标志，但根据淋巴细胞因子谱的异同识别Th1和Th2细胞仍然是目前最有效的手段，特别是细胞内因子标记的流式细胞技术。近来由于细胞因子ELISA试剂盒的不断涌现，为研究Th1/Th2细胞因子谱的变化提供了准确、可靠、快速的测定方法。但研究CD4+淋巴细胞细胞因子谱变化时需要将T淋巴细胞特异克隆。最近发现，在外周血白细胞中，除CD4淋巴细胞外，CD8细胞也存在Th1和Th2样细胞因子谱的变化，甚至酸性粒细胞也具有产生多种细胞因子的能力，如酸性粒细胞可分泌IL-4、IL-5、IL-1α、IL-6、IL-8、TNFα、TGF等。因此单纯通过细胞因子谱的变化难以有效识别Th1和Th2细胞。
根据T辅助淋巴细胞(CD4)分泌的细胞因子谱(cytokine profiles)的不同,将CD4细胞分为Th1和Th2亚群。Th1细胞主要分泌γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子-β(TNF-β),介导细胞免疫应答；而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10及IL-13等因子，促进抗体的产生，介导体液免疫反应。在多数免疫反应中，T辅助淋巴细胞并不产生典型的Th1或Th2细胞和相应的细胞因子，而主要是由Th0细胞分泌的混合型的细胞因子。但在疾病的状态下，Th0细胞受特异抗原的刺激时，一方面向Th1方向发展，另一方面可能向Th2方向发展。如在结核感染转状态下可产生Th1和Th2双向免疫反应，在I型超敏反应疾病时主要产生以Th2为主的免疫反应。近几年来研究发现，Th1/Th2平衡失调参与多种疾病过程，如肿瘤免疫、移植免疫及变态反应等，而用流式细胞仪进行Th1/Th2的检测克