体外抑菌实验方案

体外抑菌实验方案

体外实验室是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。药物对细菌代谢的影响，可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌停止生长或部分抑制，借以判断药物对细菌有无抗菌作用或抗菌范围。体外实验是细菌与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评价。

一、体外实验的准备 （一）实验菌株的选择

一般使用实验室保存的典型菌株和临床分离菌株。

（二）培养基的制备

选择适合细菌生长繁殖的营养物质的培养基

（三）实验器皿的准备

抗菌实验的步骤需用无菌操作，应用的试管、平皿、吸管等与细菌接触的器皿，均需经过高压灭菌后应用。

（四）药物的准备

实验时称取一定量的药物，铵盐基折算成效价/mg，配成溶液或制成均匀的混悬液，pH调至中性。

（五）菌液制备

抗菌药物实验是针对细菌的作用，实验菌株不能含其他杂菌。

（六）细菌计数

将菌稀释至OD值为0.002（实验时1ml菌液加1ml药液OD值降为0.001）

二、体外抗菌实验（试管稀释法）

（一）1ml药液采用8个梯度：500、100、50、25、10、5、2.5、1.25（ug）。 配置方法：

每个药液浓度为1ml，8个梯度总共694ug，取整700ug。

（1）称取700ug待测物，溶解在1.4ml溶剂中得到500ug/ml的药液。 （2）从500mg/ml的药液中取0.4ml，加入1.6ml溶剂得到100ug/ml的药液。 （3）从100mg/ml的药液中取1ml，加入1ml溶剂得到50ug/ml的药液。

（4）从50mg/ml的药液中取0.5ml，加入0.5ml溶剂得到25ug/ml的药液。 （5）从50mg/ml的药液中取0.5ml，加入2ml溶剂得到10ug/ml的药液。 （6）从10mg/ml的药液中取1ml，加入1ml溶剂得到5ug/ml的药液。 （7）从5mg/ml的药液中取1ml，加入1ml溶剂得到2.5ug/ml的药液。 （8）从2.5mg/ml的药液中取1ml，加入1ml溶剂得到1.25ug/ml的药液。 （图示如下图）

（二）1ml菌液采用OD值0.002的菌液

配置方法：菌悬液在600nm波长下测定其OD值，根据具体的OD值按10倍稀释使菌悬液的OD值接近0.002，在接近0.002后缩小稀释倍数使菌悬液OD值为0.002。

（三）菌药混合培养

取稀释药液各1ml分装于小试管内（从稀到浓可不换吸管），做好标记，然后取经培养16-18h细菌培养液，每管1ml，每小试管总量为2ml，置37℃培养箱内培养16-18h，检查结果。

（四）结果分析

如加入细菌的药液管仍未澄清，即表明无细菌生长，则该管药物有抗菌作用；如为浑浊，即表明细菌已生长，该管药物无抗菌作用。以完全无细菌生长的最低药物浓度作为细菌对药物的敏感度，即为该药物最小抑菌浓度。