实验八 分光光度法条件实验及测定微量铁（5学时）*
一、目的
1、学习如何选择吸咣光度分析的实验条件。 2、掌握用吸光光度法测定铁的原理及方法。 3、掌握分光光度计的使用方法。 二、原理
1、 光度法测定的条件：分光光度法测定物质含量时应注意的条件主要是显色反应的条件和测定吸光度的条件。显色反应的条件有显色剂的用量，介质的酸度、显色时温度、显色时间及干扰物质的消除方法等；测量吸光度的条件包括入射光波长的选择、吸光度范围和参比溶液等。
2、二氮杂菲-亚铁络合物：邻二氮杂菲是测定微量铁的一种较好的试剂。在pH=2～9的条件下Fe2+ 离子与邻二氮杂菲生成稳定的橘红色络合物，此络合物的 lgK稳 =21.3, 摩尔吸光系数ε
10510=1.1×
4
在显色前，首先用盐酸羟胺把 Fe3＋离子还原为 Fe2＋ 离子，其反应式如下： 2 Fe3＋+2NH2OH·HCl→2 Fe2＋+N2+2H2O+4H++2Cl-
测定时，控制溶液酸度在pH=5左右较为适宜。酸度过高，反应进行较慢；酸度太低，则 Fe2+离子水解，影响显色。
Bi3+，Cd2+，Hg2+，Ag+，Zn2+等离子与显色剂生成沉淀，Ca2+，Cu2+，Ni2+等离子与显色剂形成有色络合物。因此当这些离子共存时，应注意它们的干扰作用。
三、试剂
100μg/mL的铁标准溶液：准确称取0.864g分析纯的NH4Fe(SO4)2·12H2O ，置于一烧杯中，以30mL 2mol/L HCl 溶液溶解后移入1000 mL 容量瓶中，以水稀释至刻度，摇匀。
10 μg/mL的铁标准液：由100μg/mL的铁标准溶液准确移取稀释10倍而成。 盐酸羟胺固体及10%溶液（因其不稳定，需临时用时配），0.1%邻二氮杂菲（新配制），1mol/LNaAc溶液。
四、步骤 1、 条件实验
（1）吸收曲线的绘制：准确移取10 μg/mL 铁标准溶液 5mL于50mL容量瓶中，加入10%盐酸羟胺1mL，摇匀，稍冷，加入1mol/L NaAc溶液5mL和0.1%邻二氮杂菲3mL，以水稀释至刻度，在分光光度计上，用1cm 比色皿，以水为参比溶液，用不同的波长从570 nm 开始到430nm为止，每隔10nm或20nm 测定一次吸光度。然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标绘制吸收曲线，从吸收曲线上确定该测定的适宜波长。
（2）邻二氮杂菲-亚铁络合物的稳定性：用上面溶液继续进行测定，其方法是在最大吸收波长（510nm）处，每隔一定时间测定其吸光度，例如在加入显色剂后立即测定一次吸光度，经30min，60min，120min后，再各测一次吸光度，然后以时间(t)为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制A-t 曲线。此曲线表示了该络合物的稳定性。
（3）显色剂浓度试验：取 50mL容量瓶（或比色管）7个，编号，用5 mL 移液管准确移取10μg/mL铁标准溶液5mL ，于容量瓶中，加入1mL10%盐酸羟胺溶液，经2 min 后，再加入5mL1mol/LNaAc溶液，然后分别加入0.1%邻二氮杂菲溶液0.3，0.6，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0mL，用水稀释到刻度，摇匀。在分光光度计上，用适宜的波长（510nm）、1cm比色皿，以水为参比，测定上述各溶液的吸光度。然后以加入的邻二氮杂菲的体积为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制曲线，从中找出显色剂的最适宜的加入量。
（4）溶液酸度对络合物的影响：准确移取100μg/mL 铁标准溶液5 mL于100 mL容量瓶中，加入5mL 2mol/L HCl 溶液和10 mL10%盐酸羟胺溶液，经2 min后加入0.1%邻二氮杂菲溶液30mL。以水稀释至刻度，摇匀，备用。取50ml 容量瓶7支，编号，用移液管分别准确移取上述溶液10mL于各容量瓶中。在滴定管中装0.4mol/L NaOH 溶液，然后依次在容量瓶中加入溶液0.0，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，10.0mL，以水稀释至刻度，摇匀，使各溶液的pH从≤2开始逐步增加至12以上。测定各容量瓶中溶液的pH，先用pH=1～14广泛pH试纸粗略确定其pH，然后进一步用精密pH试纸确定其较准确的pH。同时在分光光度计上用适宜的波长（510nm），1cm 比色皿和水为空白测定各溶液的吸光度A。
最后以pH为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制 A-pH 曲线，从曲线上找出适宜的pH范围。
根据上面的条件实验，拟出邻二氮杂菲分光光度法测定铁的分析步骤并讨论之。
2、铁含量的测定*
（1）标准曲线的绘制：取50 mL容量瓶（或比色管）6支，分别移取（务必准确量取，为什么？） 铁标准溶液于5支容量瓶中，另一容量瓶中不加铁标准溶液（配制空白溶液，作参比）。然后各加入1mL10%盐酸羟胺，摇匀，经2min 后，再各加5ml 1mol/LNaAc溶液及3ml 0.1%邻二氮杂菲，以水吸稀释至刻度，摇匀。在分光光度计上，用1cm比色皿，在最大吸收波长（510nm）处，测定各溶液的吸光度。以铁含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）未知液中铁含量的测定：吸取5 mL未知液代替标准溶液，其它步骤均同上，测定吸光度。由未知液的吸光度在标准曲线上查出5mL未知液中的铁含量，然后以每毫升未知液中含铁多少微克表示结果。如果未知液的铁含量过高，可将试样稀释，使其在标准曲线的2/3左右处。
注意：（1）（2）两项的溶液配置和吸光度测定宜同时进行。 记录及分析结果 1、记录 比色皿 2、绘制曲线：
（1）吸收曲线；（2）A-t曲线；（3）A-c曲线；(4)标准曲线。
3、对各项测定结果进行分析并作出结论：例如从吸收曲线可得出：邻二氮杂菲亚铁络合物在波长510nm处吸光度最大，因此测定时宜选用的波长为510nm 。
（1）吸收曲线的绘制
波长nm 吸光度A 570 550 530 520 510 500 490 470 450 430
（2）邻二氮杂菲-亚铁络合物的稳定性 放置时间t/min 0 30 90 120
（3）显色剂浓度的试验
容量瓶（或比色显色剂量管）号 V（mL） 1 2 3 4 5 6 7
（4）标准曲线的绘制与铁含量的测定
吸光度A 吸光度A 试液编号 1 2 3 4 5 6 未知液 五、思考题
标准溶液的量V/mL 0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 总含铁量m（μg） 0 20 40 60 80 100 A 吸光度 1． 邻二氮杂菲分光光度法测定铁的适宜条件是什么？
2． F离子标准溶液在显色前加盐酸羟胺的目的是什么？如测定一般铁盐的总铁量，需要加盐酸羟胺吗？
3． 如用配制很久的盐酸羟胺溶液，对分析结果有影响吗？为什么？ 4． 怎样选择本实验中各种测定的参比溶液？
5．溶液的酸度对邻二氮杂菲铁的吸光度有影响吗？结果如何？ 注：时间不够可只作铁的测定，该过程只需2学时
附: 分光光度计的使用
分光光度法测量的理论依据是朗伯-比耳定律：当一束单色光通过一定浓度的稀有色容液时，溶液对光的选择吸收程度A与溶液的浓度或液层成正比即A=kcL=log(I0/I),式中：A为吸光度，表示光通过溶液时被吸收的强度；为有色溶液的浓度；I0为入射光强度；I为透射光强度；L为液层的厚度；为k吸光系数，它与入射光的波长及溶液的性质、温度等有关，见右图1所示。
L 图1光通过溶液 I0 I