UBC12的显性负性突变体阻断NEDD8并抑制NEDD8在体内的结合
NEDD8，一种新发现的类泛素蛋白，已经被证实以与泛素化相似的方式与蛋白质结合。最近，人源UBC12被认为是一个NEDD8的结合酶（E2）。当研究UBC12的体内作用时，我们发现UBC12的点突变体，显示出对NEDD8结合的显性负性作用。这个突变体是把E2家族保守的半胱氨酸残基用一个丝氨酸序列替换，可以特异性地抑制NEDD8的结合。我们观察了其对NEDD8与底物结合的显性负性作用，包括与Cullin-2半胱氨酸末端片段，完整的Cullin-1以及其他靶蛋白结合。有趣的是，UBC12（C111S）与NEDD8组成了异二聚体。这个结合在变性条件下很稳定，包括6M的盐酸胍，8M的尿素，2%的SDS或5%的巯基乙醇。我们的结果与这个假设一致：UBC12(C111S)通过形成UBC12(C111S)-NEDD8复合物来阻断NEDD8单体，其后抑制NEDD8转移到底物上。为了检验NEDD8结合的生物学效应，这种UBC12的显性负性形式通过绘制细胞生长曲线来检验。我们发现UBC12（C111S）的过表达导致U2OS和HEK293细胞生长的抑制。因此，这个UBC12的显性负性形式可以解释其他生物学系统中NEDD8修饰的作用。
NEDD8是一个由81个氨基酸组成的高度保守的蛋白，与泛素有60%同一性和80%的相似性。NEDD8的表达受心脏和成人组织骨骼肌的高度限制，并且在鼠的胚胎中受到负性调控。NEDD8和它的酵母同源物Rub1 (3, 4)属于类泛素蛋白家族，包括UCRP , sentrin-1/SUMO1 , sentrin-2和sentrin-3。这些蛋白质有一个普遍的特征，蛋白质的成熟形式总是被翻译成前蛋白的形式，就是在组成成熟蛋白的C-端的甘氨酸-甘氨酸二肽后加上一个或更多的氨基酸。在NEDD8结合的过程中，先导蛋白的C-端多肽被C-端水解酶例如UCH-L3水解。成熟形式被证明是结合到很多的核内蛋白上，包括cullin家族成员。
泛素化的途径涉及到一系列的酶促反应。第一步是一个ATP依赖型的泛素反应，通过泛素激活酶（E1）激活泛素，从而在泛素的76位的甘氨酸和E1的半胱氨酸残基之间形成一个硫酯键，接着激活的泛素被转移到另一个泛素结合酶（E2）的半胱氨酸残基上，组成另一个硫酯键。最后，在泛素的76位甘氨酸和底物蛋白的赖氨酰的ε-氨基形成异肽键。这个反应可以直接被E2酶催化或者通过第三种酶泛素连接酶E3催化。
Rub1 和NEDD8结合的方式也被认为是以与泛素化类似的方式被E1，E2，E3酶催化。事实上，酵母菌Rub1的结合被证实需要至少三种蛋白，包括体内的Ula1p/Enr2p, Uba3p和 Ubc12p。Ula1p/Enr2p 和Uba3p分别与E1泛素激活酶的N-端和C-端区域有关，并且共同完成Rub1激活的类泛素激活酶E1功能。 Rub1的结合同样需要Ubc12p，这是个与E2泛素结合酶有关的蛋白质，其功能与E2在Rub1蛋白结合过程的作用相似。
在哺乳动物NEDD8结合系统中，APP-BP1，hUBA3和hUBC12最近被证实是分别与人类同源的Ula1p/Enr2p, Uba3p和Ubc12p。APP-BP1和 hUBA3分别与E1泛素激活酶的N-端和C-端结构域类似。在体外，被翻译的hUBA3被证实在APP-BP1存在的条件下通过硫酯键连接结合成GST-NEDD8。在体外，被翻译的hUBC12同样也被证实在APP-BP1和hUBA3都存在的条件下通过硫酯键连接结合成GST-NEDD8。然而，这些人类同源物的体内功能仍未知。在体内NEDD8的结合中，APP-BP1/hUBA3的二聚体复合物还未被证实有与E1类似的功能。同样，hUBC12还未被证实在体内有与E2相似的功能。为了检测hUBC12的功
能，我们在COS细胞中过表达了hUBC12的突变体。其中一个突变体，
UBC12(C111S)，明确地显示出了对NEDD8结合的显性负性效应。这个结果强有力地支持了hUBC12在体内NEDD8结合中起作用的假设。在这篇文章中，我们研究了UBC12(C111S)并且研究了其显性负性作用的机制。
实验方法
细胞株和培养条件：美国菌种保藏中心购置的人胚肾HEK293细胞和人骨肉瘤细胞U2OS细胞，置于加了10%胎牛血清和抗生素的培养液中。
抗体—鼠源mAb 12CA5（罗氏分子生化试剂），16B12（科文斯，里士满）和兔源多克隆HA.11（科文斯）是流感血细胞凝集素肽序列YPYDVPDYA的抗体。鼠源抗-RH（对氨基酸序列RGSHHHH特异）是从德国公司购置的。鼠源抗-c-myc（对氨基酸序列EQKLISEEDL特异）是从罗氏分子生化试剂购置的。兔源抗-多克隆抗NEDD8抗血清是通过一个相对应的20-32位TDKVERIKERVEE的多肽序列免疫而获得的。Cul-1兔源多克隆抗体是从酶实验室公司购置的。
质粒构建和转染—为了表达COS细胞N末端带有抗原表位标签的蛋白，以前用pcDNA3/HA-N ,pcDNA3/3HA-N, pcDNA3/RH-N, pcDNA3/3RH-N或pcDNA3－cmyc-N质粒。哺乳动物表达载体， pcDNA3/3HA-N 或
pcDNA3/3RH-N通过在 pcDNA3中插入HA或RH三段重复的抗原表位而构建。通过使用pcDNA3/3HA-N 或 pcDNA3/3RH-N，蛋白质可以在N末端带上三个重复的表位标签，并且在哺乳动物细胞中表达。这个系统可以让我们检测出低水平的表达情况。构建pcDNA3/c-myc-N用于c-myc表位的N末端标签，c-myc接合体被插入到pcDNA3中用来构建pcDNA3/c-myc-N。人源的UBC12, UBA3, UBC9, Cul-2-DN 或Cul-1的cDNA通过从人类cDNA文库中选择恰当的引物用PCR进行扩增，GFP的cDNA通过从pEGGP-C1进行PCR实现。这些cDNA被插入到上述的质粒载体。每个cDNA的序列由DNA测序得到。带有HA标签的NEDD8突变体例如HA-NEDD8(GGG), HA-NEDD8(GG), and HA-NEDD8(G)在之前构建好的质粒中表达。质粒通过LipofectAMINE试剂转染到COS-M6细胞中。被转染的细胞在转然20小时后可进行WB或免疫沉淀试验。
定点突变—如前所述，UBC12上111位的半胱氨酸通过运用基于PCR的定点突变被替换成丝氨酸或丙氨酸。这两种突变体分别命名为UBC12(C111S)和UBC12(C111A)。同样的方法，UBC9上的93位半胱氨酸被丝氨酸替换以产生UBC9(C93S)，UBC3上216位的半胱氨酸被替换以产生UBA3(C216S)。NEDD8的结合位点，即720位的赖氨酸，被精氨酸替换从而产生Cul-1(K720R)。突变后的cDNA再亚克隆成 pcDNA3/RH-N 或 pcDNA3/c-myc-N。
免疫沉淀带RH 或3RH标签的蛋白质—为了研究NEDD8与Cul-2-DN或UBC12(C111S)的结合，将带有HA标签的NEDD8与带RH标签的Cul-2-DN或UBC12(C111S)在COS细胞中通过共转染方法进行共表达。由于RH标签的序列是RGSHHHHHH，所以带RH标签的蛋白可以用TALON树脂纯化。表达了RH标签蛋白和HA标签蛋白的细胞裂解获得全蛋白液。样品中的DNA被22GA（1mm）针过滤下来,然后全蛋白液在15℃条件下以100000g转速离心30分钟。上层清液用TALON 颗粒在室温下孵育1小时。颗粒用裂解液洗涤一次，然后用清洗液洗涤两次，最后用磷酸缓冲液洗涤两次，然后将样品在含有2% SDS 和5%巯基乙醇的溶液中50℃下放置一个小时，然后再做SDS-PAGE。
免疫印迹分析—免疫印迹是由ECL检测系统进行。二抗是用辣根过氧化物酶标记抗小鼠或抗兔抗体。
免疫沉淀反应—把文献Wada中描述的免疫沉淀反应的方法作如下修改：500万个COS细胞转染空载或质粒，用于表达3HACul1，转染后20小时用胰蛋白酶消化。细胞微球溶解在1.25毫升RIPA缓冲液中（包含1mM的苯甲基磺酰氟，1 mg/ml的亮抑肽酶，10 mg/ml的抑肽酶，1.5 mM的胃酶抑素和5 mMN-乙基马来酰亚胺）。细胞裂解液在冰上放置30分钟，样品中的DNA过Ｇ22孔针。在4℃以100000g转速离心30分钟后，上清液添加到10毫克鼠源抗HAmAb中，再加到25毫升的蛋白质G-Sepharose颗粒中。颗粒在4℃冰箱中孵育摇晃3小时。颗粒用RIPA洗5次。免疫沉淀反应用30毫升2％的SDS溶液处理，含有5%β-巯基乙醇和3毫升已溶解的样品，上样到8%的聚丙烯酰胺凝胶。然后，免疫印迹用三种抗体孵育。兔源抗HA抗体和抗Cul-1抗体用来检测3HA标签的Cul-1。兔源的抗NEDD8抗体用来检测3HA-Cul-1与内源性NEDD8结合。
细胞生长试验—将Naviglio的方法进行如下修改操作。把U2OS 细胞或HEK293细胞种植在6厘米皿上，用FuGENE 6以及5微克pcDNA3载体作为空白对照 pcDNA3/RH-UBC12(C111S), 或者pcDNA3/RH-UBC12(野生型)。过24小时后，将细胞用磷酸盐缓冲液洗2次，加入含10%胎牛血清的培养基与1 mg / ml的 G418。培养基每两天换一次液。转染后十天，收耐药细胞并计数。数据用Fisher最小显著差异统计学分析方法进行分析。
结果和讨论
UBC12（C111S）的显性负性作用对NEDD8修饰的影响—为了研究NEDD8相关酶在体内的作用，我们首先做了两种突变体，hUBA3(C216S) 和hUBC12(C111S)。hUBA3(C216S)是E1家族中在216位半胱氨酸保守序列由丝氨酸取代。 由于hUBA3是NEDD8激活酶E1的组分，并且最近被证实216位半胱氨酸与NEDD8通过硫酯键结合，hUBa3（C216S）有望成为一种对NEDD8修饰通路有抑制作用的显性负性突变体。我们做了另一种NEDD8结合酶的突变体，hUBC12(C111S)。它是111位半胱氨酸被丝氨酸序列取代。由于 hUBC12也与NEDD8通过硫酯键结合，我们同样假设它对NEDD8修饰具有显性负性作用。
解释UBC12（C111S）显性负性作用的模型—在这篇文章中，我们论证了UBC12（C111S）与NEDD8特异结合形成一个稳定化合物，从而抑制NEDD8与靶蛋白例如Cul-2-ΔN, 全长的Cul-1等的结合。为了解释这种显性负性抑制的机制，我们提出了一个模型。NEDD8的结合按照以下的途径进行：首先，NEDD8结合到E1复合物的硫酯键上。然后，NEDD8被转移到NEDD8结合酶上。最后，NEDD8的E3连接酶，如VBC，把NEDD8从NEDD8-UBC12复合物上转移到目的蛋白上。UBC12在下一个结合过程中重复进行。
目前为止，到目前为止，NEDD8的生物学功能是未知的。然而，cullin家族成员已被确定为NEDD8结合的靶蛋白。由于cullin蛋白形成E3泛素连接酶如SCF或SCF复合体，NEDD8可能会改变连接酶的活性。有趣的是，NEDD8结合位点最近发现在一个赖氨酸序列上，而这个位点处于cullin的核定位序列中。NEDD8与cullin的结合可能会调控其核易位。UBC12（C111S）,阻断了NEDD8在体内的结合过程，因而会对研究NEDD8结合的潜在生物功能提供有效的工具。