一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*
林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静
广东轻工职业技术学院，广州，510300
摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)。通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。 关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件
Study on screening and enzyme-producing conditions of a high
protease producing strain
LING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE
Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing
(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)
Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.
Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition *
基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203）。 第一作者简介：林玩庄（1994.11-），女，研究方向为生物技术。
引言
近年来，我国的水产养殖量和加工量一直居世界首位
[1-2]
。但是，在捕捞和
加工过程中，低值水产品往往占总产量的30%~50%[3-4]。如果这些低值水产品得不到高值化利用，将造成大量蛋白质资源的浪费。随着人们对低值水产品综合利用的重视，蛋白酶及其高产菌种的应用日益增加。为了直接利用高产蛋白酶菌种对低值水产品进行开发高值化产品，本实验主要筛选蛋白酶高产菌种，以及初步研究所得菌种的产酶条件。
1 材料与方法
1.1 筛选材料与试剂
筛选材料：南海海域大型鱼类的肠道组织；酪氨酸：分析纯，市售；Folin试剂及其它试剂：分析纯，市售。 1.2 培养基
富集培养基：葡萄糖 40 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，Na2HPO4 2 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH7.0。分离平板培养基：葡萄糖 10 g/L，酵母膏 5 g/L，脱脂奶粉 10 g/L，NaCl 1 g/L，琼脂 10 g/L，pH7.0。斜面培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，琼脂 10 g/L，pH7.0。种子培养基：葡萄糖 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH7.0。基础发酵培养基：葡萄糖 40 g/L，蛋白胨 5 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH7.0。 1.3 富集培养与平板初筛
用组织捣碎器将鱼类肠道组织捣碎，取10 g接入200 mL的富集培养基中，于28 °C、200 rpm的条件下培养16 h。然后，将培养液进行梯度稀释，涂布于分离平板培养基上，于28 °C培养48 h，挑取具有透明圈的菌落，接入斜面培养基，培养24 h，置于4 °C冰箱内保藏，备用。 1.4 摇瓶发酵筛选
将平板初筛所得各菌株的斜面菌种接入种子培养基，于26 °C、150 rpm的条件下培养12 h。然后，按10%的接种量将种子液接入发酵培养基，于28 °C、200 rpm的条件下培养36 h。测定发酵液中的蛋白酶活力，筛选出高产菌株。
1.5 高产菌株的鉴定
采用普通光学显微镜和扫描电镜对菌体形态进行观察，按《Bergy’s Manual of Determinative for Bacteriology》的方法对高产菌株的生理生化特征进行分析[5]，参考文献介绍的16S rDNA鉴定方法对高产菌株进行分子生物学鉴定[6-7]。 1.6 碳源和氮源对产酶的影响
改变基础发酵培养基的碳源和氮源，分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉为唯一碳源，分别以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸铵、尿素为唯一氮源，经36 h摇瓶发酵，测定发酵液中的蛋白酶活力，根据结果选择最佳的碳源和氮源。 1.7 环境条件对产酶的影响
采用最佳的碳源和氮源配置发酵培养基，分别在不同的温度、初始pH和摇瓶转速下进行产酶发酵，测定各种环境条件下的蛋白酶活力，确定最佳的摇瓶发酵条件。
1.8 产酶曲线的分析
在最佳的摇瓶发酵条件下进行产酶发酵，每隔6 h测定发酵液中蛋白酶活性，根据蛋白酶活力变化情况，确定最佳的产酶时间。 1.9 蛋白酶活力的测定
采用GB/T 23527-2009中的Folin法测定发酵液中的蛋白酶活力[8]。样品测定时，调节发酵液pH至7.5，于4°C、10000 rpm下离心去除菌体，以pH7.5的磷酸盐缓冲液对上清液进行适当稀释，取 1 mL稀释液，加入1 mL酪蛋白溶液(10.0 g/L)，于40 °C水浴中反应10 min，再加入1 mL三氯乙酸溶液(65.4 g/L)终止反应，经过滤，取1 mL滤液，加入5 mL碳酸钠溶液(42.4 g/L)和1 mL Folin试剂，混匀，置于40 °C水浴中显色反应20 min，于680 nm波长下测定吸光值。在样品测定前，先配制一系列标准浓度的酪氨酸溶液，取1 mL标准溶液，按上述方法进行显色反应，于680 nm波长下测定吸光值，以酪氨酸浓度为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线的回归方程，计算样品反应液中的酪氨酸生成量，从而确定样品的蛋白酶活力。蛋白酶活力的定义为：在pH7.5和40 °C的条件下，1 min水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸为1个活力单位(U)。
2 结果与讨论
2.1 酪氨酸的标准曲线
酪氨酸的标准曲线如图1所示。其线性回归方程为：y=0.0109 x + 0.0048，相关系数R2为0.9997。
0.7000.600y=0.0109 x + 0.0048R2=0.9997680 nm下的吸光值 0.5000.4000.3000.2000.1000.0000102030405060酪氨酸浓度 (?g/mL)图1 酪氨酸标准曲线 Fig.1 Standard cure of tyrosine
2.2 蛋白酶高产菌株的筛选
通过对富集培养液进行平板分离，共挑取32株在菌落周围具有透明圈的菌株。采用摇瓶发酵方法对各菌株进行复筛，其中蛋白酶活力较高的8株菌株的发酵结果如图2所示。从图2可看出，菌株PE11发酵液中的蛋白酶活力最高，故被选为进一步研究的菌株。
280240200蛋白酶活力 (U/mL)16012080400PE03PE06PE11PE14PE17PE23PE25PE32菌株图2 8株菌的摇瓶发酵筛选结果
Fig.2 Screen result of 8 strains with shake flask fermentation test
2.3 菌种PE11的鉴定
在普通显微镜下，菌种PE11的革兰氏染色阳性。其扫描电镜(×10,000)的摄像如图3所示，菌体呈杆状，大小约为(2.6~4.7) μm × (0.5 ~0.6) μm。通过生理生化试验，结果如表1所示。通过形态特征和生理生化特征的分析，可初步判断菌种PE11为芽孢杆菌属。对菌种PE11的16S rDNA进行PCR扩增，PCR产物经纯化、测序，获得1512 bp的序列，经过在NCBI中对其同源性进行检索，发现菌种PE11与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的许多菌种的同源性达99%。其中，菌种PE11与Bacillus amyloliquefaciens V3 (登录号:KJ123715.1)的亲缘关系最近。采用Neighbor-joining法构建系统发育树，菌种PE11的系统发育树如图4所示。经过16S rDNA分子生物学的分析，菌种PE11被进一步鉴定为解淀粉芽孢杆菌。