1.如何使光镜发挥最好的功能效果？（进行操作）
答：首先要认识其构造及各部件的功能，同时要掌握正确的调试、使用和保养方法，才能在实际应用中面对各种要求时以不同的显微镜检方法，充分发挥显微镜应有的功能，提高常规检验工作效率.
2.相差显微镜与普通光镜相比有哪些特殊结构？（进行操作）
答：1.相差显微镜和普通显微镜的区别是:用环状光阑代替可变光阑， 用带相板的物镜代替普通物镜??2.最大的优点是可以观察未经染色的标本和活细胞 3.试诉荧光显微镜的原理和用途？（并操作）
答：荧光显微镜是以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 4.暗场显微镜光挡如何制作？（并操作）
答：通用的光档照明法有两种：中心遮光法：用中央纸板遮去中央光束，然后将这样的纸板放在聚光器下面的遮光片支架上，修整遮光面积和纸板大小，遮去聚光在聚光器焦点的直接照明光线的中央光束，视野基本黑暗，而保证侧面斜射过来的光照亮被检物。暗视野聚光器法：常用抛物面聚光器，中央有黑挡板以遮光，并使落在抛物面上的光线无法反射出来，当暗视野聚光器的数值孔径大于物镜的孔径数值时，照明光线不能进入物镜，只有标本的散射光线进入物镜。使用时，将一般显微镜的聚光器换成暗视野聚光器，作合轴调节，在聚光器与载玻片之间加一滴香柏油，即可进行调焦观察，用毕后及时擦去香柏油。(细胞实验课本第8页)
5.试诉酸性磷酸酶显示法的原理及主要步骤？
答：酸性磷酸酶显示法原理：酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的特征性酶，主要存在于巨噬细胞中，定位于溶酶体内。正条件下，巨噬细胞处于休止状态，酶活性很低。但在合适的pH条件下，经过活化，其形态、代谢和功能上表现出一系列显著的变化，如膜活性增高和酸性磷酸酶活性增强，从而改变其渗透性，底物可以渗入，酶活力被显示。通常酸性磷酸酶在pH为5左右时发挥作用能水解磷酸酯而释放出磷酸基，PO43-与底物中硝酸铅反应生成磷酸铅沉淀物。由于这些沉淀物是无色的，需再与黄色的硫化铵反应，生成棕黄色到棕黑色的硫化铅沉淀而被显示出来。其反应过程如下：
3-
β-甘油磷酸钠+酸性磷酸酶→甘油+PO4PO43-+Pb(NO3)2 →Pb3(PO4)2↓
Pb3(PO4)2+(NH4)2S →PbS↓(棕黑色) 主要步骤：
1、 前处理：获取小白鼠或大白兔腹腔液 2、 制片：
⑴、将腹腔液滴一滴于冰冻的干净载玻片上，用牙签涂开，自然干燥。 ⑵、标本放入作用液中，37℃保温30min。 ⑶、蒸馏水中漂洗片刻。
⑷、放入甲醛钙固定液中固定5min。 ⑸、蒸馏水中漂洗。
⑹、放入2%硫酸铵液中3~5min。 ⑺、蒸馏水中漂洗，镜检。
显微镜下观察小鼠或大白兔腹腔巨噬细胞为不规则形状，阳性细胞内有大小不等的棕色或棕黑色的颗粒即为酸性磷酸酶。
对照实验：标本放入作用液前先用高温（50℃）处理 30min，使酶失去活性，做好标记，其他步骤相同。也可在对照组的作用液中不加入β-甘油磷酸钠，而以蒸馏水代替。(细胞实验课本第58~59页)
6.试诉DNA的Feulgen染色法的原理及主要步骤？
答：⑴Feulgen染色法的原理：DNA是由许多单核苷酸合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸，脱氧核糖和碱基构成。DNA经1mol/L盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的
键打开，使脱氧核糖的第一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与席夫试剂反应。席夫试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成的无色品红液，无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。因此，凡有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生是由于反应产物分子中含醛基，醛基是一个发色基团，所以具有颜色。材料不经过水解或预先用热的三氯乙酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。 ⑵主要步骤： 对照组：5%三氯乙酸 → 70%酒精 → 蒸馏水 90℃ 15min 2至3min 洗一次 取材→Carnoy固定 1mol/LHCL 解离 实验组：
→席夫试剂 → 亚硫酸水 → 流水冲洗 → 固绿复染→ 水洗 → 制片观察
处理 处理 8至15min 1min
7.固定液的作用是什么？说出我们实验中所用过的几种不同的固定液及它们的实用范围？ 答：⑴固定夜的作用：组织和细胞离开机体后，在一定时间内仍然延续着生命活动，会引起病理变化直至归于死亡。为了使标本能反映他生前的正常状态，必须尽早的使用某些化学药品迅速的杀死组织和细胞，阻止上述变化，并将结构成分转化为不溶性物质，防止某些结构的融化和消失。这种处理就是固定。除了上述作用外，固定剂会使组织适当硬化便于随后的处理，还会改变细胞内部的折射系数并使某些部分易于染色。 ⑵我们实验中用到的固定液
动物肝细胞线粒体的分离与观察 固定液 甲醇：冰醋酸=9：1
细胞中酸性磷酸酶的定位 甲醛钙固定液：甲醛10ml，10ml，蒸馏水80ml 植物细胞骨架的光学显微镜观察 固定液：3%戊二醛 DNA的Feulgen染色法 Carony固定液
简单固定剂即单一固定剂，常有的有乙醇，甲醛，冰醋酸等。乙醇只能凝固清蛋白，而冰醋酸只能凝固核蛋白，甲醛对这两种蛋白都不凝固。
简单固定剂的局限性大，如将其适当混合，制成复合固定剂可以取得更好的效果。常有的混合固定剂有Carony改良液（3份无水乙醇+1份冰醋酸），Bouin液等 8.常用的组织破碎的方法有哪些？各自的适用范围如何？
答：不同实验规模、不同实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。一些坚韧组织，如肌肉、植物的根茎等，常需要强烈的搅拌或研磨作用，才能把其组织细胞破坏。而比较柔软的组织如肝、脑等，用普通的玻璃匀浆器即可达到完全破坏细胞的目的。对同一实验材料，由于实验目的(要求)的不同，采用的破碎方式也存在一定差异，如提取中的核酸和提取其中的核苷酸，前者必须保持十分温和的条件，以保持分子的完整性；后者可采用强烈手段。
1.机械法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等。
1)组织捣碎机: 一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等，转速可高达10000rpm/M以上。由于旋转刀片的机械切力很大,制备一些较大分子,如核酸则很少使用。 2)匀浆器: 匀浆器的研钵磨球和玻璃管内壁之间间隙保持在十分之几毫米距离，破碎细胞的程度比组织捣碎机高。制作匀浆器的材料，除玻璃外，还可以用硬质塑料、不锈钢、人造荧光树脂等。
3)研钵: 多用于细菌或其他坚硬植物材料，研磨时常加入少量石英砂，玻璃粉或其他研磨剂，以提高研磨效果。
4)细菌磨: 是一种改良了的研磨器，比研钵具有更大的研磨面积，而且低部有出口。操作时先把细菌和研磨粉调成糊状，每次加入一小勺，研磨20-30秒即可将细菌细胞完全磨碎
2．物理法 主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。在生化制备中常用的方法有： 1)反复冻溶法: 先将样品深冷至-15---20度使之冻固，再缓慢的融化，反复多次，多用于动物性材料。
2)急热骤冷法: 将材料投入沸水中，维持85-90分钟，至水浴中急速冷却，此法可用于细菌及病毒材料。
3)超声波处理: 频率一般选在10KC至200KC，功率200-500瓦范围，处理时间有数分钟至数十分钟不等，处理过程中注意冷却。此法多用于微生物材料。 3．化学及生物化学法 有自溶法，酶解法和表面活性剂法等。 1)自溶法: 在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎的方法。此过程需较长时间，常用少量防腐剂如甲苯、氯仿等防止细胞的污染。 2)酶溶法: 利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂酶等，将细胞壁分解，使细胞内含物释放出来。
3)表面活性剂处理: 如十二烷基硫酸钠、氯化十二烷基吡啶等。 9.什么是差速离心法、密度梯度离心法？各自的用途如何？
答：差速离心法：是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮，将较小的颗粒沉降，以此类推达到分离不同大小颗粒目的。
用途： 分离大小不同及其他更轻的细胞器和大分子。
密度梯度离心法：亦称平衡密度梯度离心法。用超离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子溶液，则溶液内比溶剂密度大的部分就产生大分子沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在重力和浮力平衡的位置，集聚形成大分子带状物。利用这种现象，测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根据其差别进行分析的一种沉降平衡法。 用途： 可用来分离核酸、蛋白质、核糖体亚基及其它成分。 10 染色法有哪些方式？各如何进行？
答：如果是蛋白电泳的话，常用的染色方法主要是考马斯亮蓝法，银染法，荧光染色法和负染法。最普遍的染色方法是考马斯亮蓝法，因为便宜而且操作简单。而银染法比考马斯亮蓝法灵敏度要高，但一个问题是银染法会影响到质谱检测，而且银染法比考马斯亮蓝法步骤要复杂而且贵些。效果最好的应该是荧光染色法，荧光染色法灵敏度高而且不会影响到质谱检测，但最为昂贵。
吉姆萨（Giemsa）染色法 ：吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。
嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞 胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。
PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均不蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏三性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色 偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用正经片必须清洁，无酸碱污染。配制顼特液必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。 染色体染色法：醋酸洋红溶液或龙胆紫溶液
先用95%的酒精解离，再用水漂洗10min,然后用上述溶液染色3~5min。 苏木精 — 伊红染色法
苏木精染液为碱性 ，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ；伊红为酸性染料 ，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色 。 易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性和嗜酸
装片大多数时候都用这种染色法，观察某些结构才需要其他染色。
11 显示染色体的实验，其材料往往要作什么预处理？取材部位如何选择？
答：预处理：适宜浓度的秋水仙素。取材：生长旺盛或具有高度分裂能力的部位。 12 简诉膜蛋白分离的过程，如何证明一膜蛋白是内在蛋白还是外在蛋白？
答：过程:1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
3、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心
4、溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min 5、收集水相留作分析
6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心
7、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积 8、用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验 试剂：
1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂 2、缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer） 3、buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5) 150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
13 试诉用卡马斯亮蓝R250来显示细胞微丝骨架的原理及应注意的事项？
答：原理：细胞骨架是由蛋白质斯组成的复杂网状结构，可分为微管、微丝和中间纤维。用适当浓度的tritonx-100处理细胞，可将细胞质膜中和细胞之中的蛋白质和全部脂质抽提，单细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存，经用戊二醛固定，考马斯亮蓝r250染色后，可在光学显微镜下观察到有微丝组成的微丝束为网状结构，就是细胞骨架。
注意事项：1洋葱内表皮细胞在进行处理前必须在ph6.8的磷酸缓冲液中下沉。2固定，染色时间必须足够
14 进行细胞内的物质或结构原位显示的方法有哪些？各有什么特点？
答：细胞化学活体染色的方法、荧光标记免疫抗体的方法 细胞化学活体染色的方法特点：活体染色是利用某些无毒或毒性很小的染料来显示细胞内某些天然结构，而不影响细胞的生命活动或产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡、
荧光标记免疫抗体的方法特点：荧光抗体标记是将荧光素以化学方法与特异性抗体共价结合， 形成荧光素-结合蛋白质化合物（即荧光标记抗体），此结合物仍保留着抗体活性，同时具有荧光素的示踪作用。
15 如何进行线粒体的分离与鉴定？（并说明原理）
答：分离线粒体，可将组织匀浆液悬浮在悬浮介质中进行差速离心。在一定的离心场中（选用离心机一定转速），大小不一的颗粒沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
线粒体的鉴定可用詹纳斯绿活染法，线粒体被染成蓝绿色，从而鉴定。 16 在分离出线粒体后，若要对其深入研究，技术路线如何？
答：将提取的线粒体制成悬浊液，滴一滴放在载玻片上，然后用詹姆斯绿B染色20到30分钟后，在显微镜下观察即可。
17 在使用高速离心机时，要注意哪些问题？
答：1.放置离心管的时候一定要对称的放置！这样才能保证转起时不偏，比如有四个放置离心管的位置，一定要放入两个离心管而且是隔一个放一个。2.在开启离心机的时候一定要将离心机的盖子盖实。
3.开启和关闭离心机应该让速度缓慢增速或减速启动。在保证离心管对称同时，也要保持重量相当，这样保证机器平衡运转和数据真实稳定。液体最好不要沸点太低，应注意离心腔内外气压比。
如果是有毒试剂还要做好通风处理。机盖的密封：机盖因是可翻式，与机壳接合面应有可靠的密封措施，如果因密封结构或材质防腐失效，就可能造成液、气相的泄漏，对环境、人员造成伤害。 密封槽结构、密封条的防腐性能，在设计与选用时应充分考虑其密封性能和可靠性能。
18 在分离叶绿体时发现分离出来的叶绿体很小，如何验证是否是由于该材料的叶绿体本来
就小还是由于分离时破碎造成的？
答：将所获得的叶绿体悬液小心加到做好的percoll梯度上，10500g，4℃离心10min，如果条带位于较上方的梯度，则为破碎的叶绿体，如果条带接近于梯度底部，则为完整叶绿体，叶绿体本身较小。
19 叙述“细胞膜的渗透性”实验的原理，主要步骤和应注意的问题？
答：实验原理：细胞膜允许一些物质通透，又能降低甚至阻挡另一些物质的通透，此即细胞膜的选择通透性。
细胞位于低渗溶液中时，水分子大量进入到细胞中，使细胞膨胀，进而破裂，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，即溶血现象 溶血现象发生快慢和物质分子质量大小有关，分子量大的发生溶血所需时间短。 溶血现象发生快慢与脂溶性大小有关，脂溶性打的发生溶血所需时间短。
溶血现象发生快慢与电解质和非电介质溶液有关，非电解质进入细胞快，溶血现象发生时间就较短。通过电解质与非电解质溶液渗透压大小与发生溶血现象的关系确定等渗溶液。 主要步骤：
1. 分子质量大小与发生溶血的关系
（1） 取三支试管，分别加入2ml 1mol/L的乙二醇、丙三醇、葡萄糖高渗液。
（2） 分别各加入1ml血液，混匀。 （3） 观察记录溶血发生时间。
2. 脂溶性大小与发生溶血的关系
（1） 三支试管，分别加入2ml 3mol/L的甲醇、乙醇、丙醇。
（2） 分别各加入1ml血液，混匀。 （3） 观察记录溶血时间。
3. 电解质和非电解质溶液与发生溶血的关系
（1） 十六支试管，分为A、B两组。
（2） A组依次加入2ml的M/8，M/9，M/10，M/12，M/13，M/14，M/16，M/18的葡萄糖溶液。
B组依次加入2ml的M/8，M/9，M/10，M/12，M/13，M/14，M/16，M/18的氯
化钠溶液。
（3）A、B组各管加入1ml血液，轻轻混匀。
（4）观察记录溶血发生时间，确定等渗浓度。
注意问题：
1.离心机使用时，要将配平后的离心管对称放置在离心机内，禁止未配平就放入离心机和非对称放入离心机。
2.中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。
3.溶血较快的试管，用显微镜观察时要注意滴加血液后立即镜检，否则会看不到实验结果。 20 用什么样的简便方法来证明叶绿体类囊体进行磷酸化的机制？实验时要注意什么？ 答：机制是通过质子梯度推动cf1发生磷酸化作用，简便方法证明可以通过人工去除或加上质子浓度梯度观察结果，可用显微注射的方法。
21 在制作洋葱根尖细胞有丝分离或染色体装片时解离的目的是什么？解离到什么程度为宜？
答：制作染色体装片时解离的目的是：是把细胞膜和细胞核分开。解离是用10％的盐酸溶液和95％的酒精溶液溶解细胞壁之间的中层物质（胞间质），使组织中的细胞相互分开。解离液中酒精的作用是迅速杀死细胞，固定细胞的分裂相；而盐酸的作用是使洋葱细胞的细胞壁软化，并使细胞间的中胶层物质溶解，从而达到分离细胞的目的。 解离的程度：根尖酥软
22 细胞有丝分裂装片的制作与染色体标本制作两个实验的目的和过程的区别是什么？ 答：实验目的
细胞有丝分裂装片的制作：1 掌握有丝分裂过程中各时期的主要特点；2 掌握有丝分裂标本临时压片技术。
染色体标本制作：掌握常规压片法和去壁低渗法制备植物染色体标本的基本原理和方法 实验过程
细胞有丝分裂装片的制作： 取材——预处理（秋水仙素处理）——固定（caronoy固定液）——解离（1mol/L HCL处理8~10 min）——蒸馏水水洗——染色（Giemsa染色）——水洗——压片观察
染色体标本制作： 取材——预处理（秋水仙素处理）——固定（caronoy固定液）——水洗——酶解（用纤维素酶和果胶酶在25摄氏度处理2~4h）——水洗——低渗（蒸馏水中浸泡30min）——冰乙酸（处理20min）——固定（caronoy固定液固定30min）——水洗——染色（Giemsa染色）——水洗——压片观察 (参照最后一次实验报告；《细胞生物学实验教程》80页和97页)
23 试诉淀粉粒的形成及实验观察方法？
答：淀粉是葡萄糖分子聚合而成的长链化合物，它是细胞中碳水化合物最普遍的贮藏形式，在细胞中以颗粒状态存在，成为淀粉粒。淀粉是由质体合成的，光合作用过程中产生的葡萄糖，可以在叶绿体中聚合成淀粉，暂时贮藏，以后又可分解成葡萄糖，转运到贮藏细胞中，由淀粉体重新合成淀粉粒。
实验观察方法：用刀片切取马铃薯块茎薄皮，放在盛有生理盐水的培养皿中，37℃下浴浮。然后捞出置于载玻片中央，滴加生理盐水，制备两张装片，其中一张滴加KI溶液染色，两张对比，镜检。染色的装片可见有许多蓝色的球形或椭球形的颗粒，即为淀粉粒。未染色的装片也可看到球形或椭球形的透明颗粒，即淀粉粒。
24 超活染色对染料有什么样的要求？线粒体或液泡系的超活染色要取得好的效果，染料要如何处理？
答：①理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这是因为它具有溶解于类脂质的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料。
②把洋葱鳞茎内表皮或切碎的新鲜猪肝组织，置于生理盐水中，并将其放到37摄氏度的恒温水浴箱上适宜时间，使线粒体处于活性状态。其中将猪肝组织溶液用两层纱布进行过滤得到滤液。
25 Garnoy固定液中各成分的作用特点是什么？ 答：Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）
①冰乙酸 冰乙酸能使核酸沉淀，组蛋白溶解，主要作用是使细胞膨胀、染色体铺展，经乙酸固定的物质，还能抵消甲醇的硬化作用。
②甲醇 迅速穿透组织，沉淀蛋白质，具有脱水性。使细胞发生组织硬化、脱水，有固缩作用。
冰乙酸使染色体片段过分膨胀，故要形成染色体的详细结构，必须把它与甲醇一道使用，后者能使组织收缩和硬化。
内部资料，请勿外传！