生物催化原理与应用在手性药物合成领域的进展
1.生物催化的特点
生物催化是指利用酶或者生物有机体 （全细胞、 细胞器、组织等 ） 作为催化剂进行化学转化的过程，又被称为生物转化。生物催化反应具有高度的化学、 区域和立体选择性， 应用生物催化不对称合成技术生产手性药物可获得的产物光学活性纯度高， 产率高， 有些可达 100%[1] 。微生物是生物催化中常用的有机体催化剂，本质是利用微生物细胞中的酶催化非天然有机体化合物的生物转化，转化液经分离纯化可得所需产品的过程 [2] 。自然界中微生物种类繁多， 含酶丰富， 因此利用微生物可进行多种生物转化反应。微生物生物转化反应具有选择性高， 尤其是立体选择性高的特点， 可顺利地完成一般化学方法难以实现的反应； 反应条件温和， 尤其适用于不稳定化合物的制备。微生物生物转化既可以采用游离的细胞， 也可以使用固定化细胞作为催化剂进行转化。到目前为止， 微生物生物转化法已在一些有机酸、 抗生素、 维生素、 氨基酸、 核苷酸和甾体激素等方面实现了工业化生产 [3] 。生物催化技术能够大大地增加衍生物的多样性，能够有效地对复杂产物进行结构修饰和从简单的分子构建新的化合物库， 在此过程中， 往往能够发现新的生理活性物质。利用生物催化发现先导化合物的优越性在于：①可能进行反应的范围广； ②能够定向进行区域选择和立体选择； ③不需基团保护和脱保护， 一步实现所需的反应； ④在温和和均一的条件下可容易地实现自动化和一步反应的重现性；⑤温和的反应条件保证了复杂易变的分子结构的稳定性；⑥高的催化活性可以降低催化剂的用量；⑦酶的固定化可以使催化剂反复和循环使用； ⑧生物催化剂可在环境中完全被降解。生物催化过程一般无污染或污染较少、 能耗相对较低， 是一种环境友好的合成方法 [4]
。
2.手性化合物的认识与发展
手性是自然界物质的基本属性， 构成生命有机体的分子都是不对称分子， 生命中普遍存在的糖为 D 型、 氨基酸为L 型、 DNA 的螺旋构象和蛋白质都是右旋， 并且生命体内许多内源性化合物， 包括与药物发生药动学和药效学相互作用的天然大分子都具有手性。因此手性药物已成为国际新药研究与开发的新方向之一 [5] 。
2005 年世界手性药物的总销售额达到 1 720 亿美元，2010 年可望超过 2500 亿美元[6] 。这一发展趋势的内在动力来源于单一对映体手性药物巨大且仍在不断增长的市场需要。而生物催化手性化合物具有一般化学方法无可比拟的优点:反应条件温和、 产物比较单一、 具有很高的立体选择性、 区域选择性和化学选择性， 并且能完成一般化学方法难以完成的反应等， 这使得生物催化合成手性化合物的方法成为日益关注的热点 [7] 。 3.手性药物的概念与药物作用的特性
手性药物是指分子结构中含有手性中心或者不对称中心的药物， 它包括单一立体异构体、 2 个或 2 个以上立体异构体的混合物。由于药物作用靶点(如受体、 酶或离子通道等)结构上的高度立体特异性， 手性药物的不同立体异构体与靶点的相互作用不同， 从而产生不同的药理学活性， 表现出立体选择性[8] 。手性
药物又可以分为:(1)光学异构体， 光学异构又称旋光异构， 是立体异构的一种。从分子的对称性来看， 分子中不存在旋转- 反映轴。当分子中一个碳原子与 4 个不同的原子或原子团链接时， 就可能有 2 种光学异构体。使偏振光向左旋的称左旋体或 l- 体， 使偏振光向右旋的称右旋体或 d- 体。他们的空间结构像实物和镜像或者左手和右手的关系， 彼此互为对映体。如青霉素， 这种抗生素的成效取决于病菌细胞内的丙氨酸属于 D 型异构还是 L 型异构， 因为青霉素必须且只能模仿细菌壁上的 D 型丙氨酸链且通过这样与细菌中的转肽酶反应并抑制起作用 [9] ;(2)几何异构体， 因双键或者碳原子的单键不能自由旋转而引起的异 构体称为几何异构体， 又称顺反异构体。如二十世纪 50 年代中期 ， “反应停” (Thalidomide， 沙利度胺)作为镇静剂用于消除孕妇早期妊娠反应， 但不久就发现服用此药的孕妇生出的婴儿出现畸形， 经研究发现具有镇静作用的是 R- 对映体， 而致畸作用的是由 S- 对映体引起的[10] 。 手性药物进入体内后与机体内具有高度立体特异性的代谢酶及血浆蛋白或转运蛋白等相互作用， 手性药物的不同异构体在体内也将表现出不同的药代动力学特征， 具有立体专一性。需要注意的是， 有些手性化合物在体内甚至可能发生构型变化而改变其药效和毒副作用 [11] 。 4.手性药物的合成
手性药物的生产分为化学法和生物学法。化学方法手性拆分难度大, 试剂昂贵,且造成资源浪费和环境污染, 不利于工业化生产;生物转化法较化学合成具有明显优势。生物转化实质是酶促反应, 酶促反应具有化学选择性、 区域选择性、 和对映体选择性, 利用酶的这些性质可以合成手性药物。合成手性药物的生物转化反应大致可分为两类: 一类是把外消旋体拆分两个光活性的对映体; 另一类是从外消旋体或前手性的前体出发, 通过催化反应得到不对称的光学活性产物。 4.1生物拆分制备手性化合物
外消旋体的拆分是指将外消旋混合物中的一对对映体进行分离的方法， 生物拆分即微生物或酶的选择性拆分就是利用生物酶或者是含有活性酶的微生物菌体作为生物催化剂， 将其中一个对映体进行选择性转化， 达到外消旋拆分的目的。 4.1.1酰基转移酶
采用酰基转移酶 I( acylase I) 拆分化学合成的消旋体N-酰基-氨基酸来制取对映体纯 D-或 L构型氨基酸, 在氨基酸工业生产上是非常重要的方法将化学合成的 DL?氨基酸乙酰化后, 用米曲霉的酰基酶水解拆分, 可得到 L-氨基酸和 D-乙酰氨基酸。D-异构体可经消旋反复利用再拆分, 理论上可得到 100% 的单一异构体, 用此方法也可获得非天然的 D-氨基酸。( 如 D-丙氨酸, Pfizer 公司人工甜味剂 alitame 的组成分) 。这是比较经典的酶法拆分方法, 这种方法几乎适用于所有合成法生产的 DL-氨基酸的拆分。由于合成 DL-氨基酸成本低廉, 不少 L-氨基酸可以用酶法拆分制备。利用氨基酰化酶进行乙酰-DL-氨基酸不对称水解反应, 然后再利用生成的 L-氨基酸与N-酰化-D-氨基酸的溶解度之差进行分离,所制得的 L-氨基酸光学纯度好、 收率高, 而且 D 型组分很容易消旋化。1955 年这种方法就已用于工业生产, 1969 年日本 制药的千 一郎( Chibata I)开始采用固定化酶装置连续生产。固定化米曲霉( Asp.oryzae) 产生的氨基酰化酶柱非常稳定, ( 酶活性下降时可补加酶溶液进行简单的再生) , 使用期达5 年以上。一个 1 000 L 酶柱月产量 10~ 32 t。此方法适用于多种 L-氨基酸的生产。这种方法曾用于生产 L-丙氨酸、 L-蛋氨酸、 L-色氨酸、 L-缬氨酸等。我国最近报道筛选了高酶活的菌种, 用于 L-蛋氨酸的生产, 并较好地解决了 D-乙酰蛋氨酸的消旋
问题。可望实现大规模工业化生产[12]。 4.1.1 脂肪酶
4.1.1.1脂肪酶催化合成(s)-萘普生
萘普生[(+)α一甲基一6一甲氧基一2一萘乙酸]是世界上应用最多的非甾体类抗炎镇痛药物。临床研究表明，(s)一萘普生的生理活性是其对映体的28倍，并作为单一对映体药物用于人体。Salgin[13] 等用皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)在超临界二氧化碳存在下的含水缓冲溶液／异辛烷反应体系中立体选择性水解消旋萘普生甲酯。结果发现，对映体比率随着反应时间的延长而升高，对映体选择率(E)为236，转化率(z)为41．6％，产物对映体过剩值(eep)为98．2％，底物对映体过剩值(ees)为70．0％。在超临界二氧化碳中选择合适的反应体系和实验条件，产物对映体过剩值、对映体比率、转化率、酶活性和稳定性均能达到较好的水平。 4.1.1.2脂肪酶催化合成(s)-酮洛芬
酮洛芬(α一甲基-3-苯甲酰基一苯乙酸)的羧基口一碳是手性中心，存在(R)一和(S)一对映体。然而，(S)一酮洛芬和(R)一酮洛芬却显示了不同的药理活性。(S)一对映体可用于减缓炎症和减轻疼痛，而(R)一对映体活性很低，甚至在有些情况下，还有不必要的生理副作用和毒性。最近，Long等[14]克隆了粘质沙雷菌ECUl010的一种脂肪酶，并在大肠杆菌中表达，这种重组脂肪酶能立体选择性水解(R，S)一酮洛芬酯合成(S)一酮洛芬，eep达到91．6％，E达到63，z高达48．2％。重组脂肪酶也表现了很高的立体选择性，这为得到具有更高活性的脂肪酶提供了另外一条途径。
4.1.1.3脂肪酶催化合成(s)-布洛芬
布洛芬[2一(4一异丁基苯基)丙酸]是常用的非甾体类抗炎镇痛药物，广泛用于治疗头痛和轻微的疼痛。消旋布洛芬的两个对映体只有(S)一对映体具有抗炎的特性|。有报道称(S)-布洛芬酸的镇痛作用是(R)一对映体的160多倍，(R)一布洛芬不仅没有活性并且还可能引起副作用。为了合成光学纯的(S)一布洛芬，很多研究者对脂肪酶催化消旋布洛芬的酯交换反应进行了研究。Wang等[15]在亲水醋酸纤维素／疏水聚四氟乙烯薄膜复合材料中设计了一种特殊的微结构作为脂肪酶的载体，手性拆分消旋布洛芬，产物对映体过剩值和对映体选择率均比自由脂肪酶催化体系显著提高，这种固定化载体改善了脂肪酶的立体选择性和稳定性。 4.1.1.4脂肪酶催化合成(S)一氟比洛芬
与当前使用的大多数芳基丙酸类NSAIDs相比，氟比洛芬[2一(2一氟一4一联苯)一丙酸]是以R(一)一体和S(+)一体的混合形式被人体吸收的。越来越多的研究表明，R(一)一氟比洛芬和S(+)一氟比洛芬具有不同的药理学活性。Bae等[16]用来自粘质沙雷菌ES一2的脂肪酶立体选择性水解(R，S)一氟比洛芬乙酯合成(S)-氟比洛芬。反应24 h后，在获得较高转化率的同时，ee、z和E分别高达98．5％、45．1％和332，显示该酶在合成(S)一氟比洛芬方面具有良好的应用前景。 4.1.2丝氨酸肽链内切酶
内切酶是一类水解酶，能催化肽键的水解，因此也能水解蛋白质。这类酶也具有高的化学、区域和立体选择性，反应条件温和(pH 6～8)且易于处理，不需要辅因子。传统上内切酶一直应用于食品工业，由于其高度立体选择性，它们已作为生物转化催化剂应用于化学工业，而且广泛应用于肽的合成和作为在动力学拆分过程中酯交换反应的催化剂。瑞士的霍夫曼拉一罗氏公司利用枯草杆菌蛋白酶催化 水解2一苄基一3一(2一甲基一1一吗啉代一1一氧代丙烷一2一基磺酰基)丙酸乙酯，得到手性(S)一2一苄基一3一(2一甲基一1一吗啉代一1一氧
代丙烷一2一基磺酰基)丙酸，它是合成肾素抑制剂瑞米吉仑和环丙吉仑的手性中间体。在这个过程中，枯草杆菌溶素悬浮在水一有机溶剂两相体系(1：1)，产率50％，对映体过量大于99％[17]。 4.1.3 环氧化物水解酶
环氧化物水解酶广泛存在于自然界中, 在哺乳动物、 植物、 昆虫、 丝状真菌、 细菌以及赤酵母中均有发现。环氧化物水解酶是一组功能相似的酶系, 能够立体选择性地催化水解环氧化合物生成光学活性环氧化物和相应水溶性的邻位二醇 ,因此在手性催化反应中有重要作用。近年来, 环氧化物水解酶的不对称催化反应已经成为合成靶物质的重要方法。Cleij[18]等利用黑曲霉环氧化物水解酶催化 α-甲基-异丁基苯乙烯环氧化物得到了光学活性的环氧化合物开环。这个开环化合物可进一步用于合成生物活性抗炎药物( S)-异丁基苯丙酸( 布洛芬)。 4. 1. 4α-酮酸脱羧酶
α-酮酸脱羧酶包括丙酮酸脱羧酶、 苯甲酰甲酸脱羧酶和苯基丙酮酸脱羧酶, 到现在为止, 丙酮酸脱羧酶是α-酮酸脱羧酶中了解最多的酶。后 2种研究相对较少。丙酮酸脱羧酶广泛分布于小麦、 玉米、 水稻、大豆等植物中。它是一种焦磷酸硫胺素( T PP) 依赖性的非氧化酶, 在 T PP 和Mg 2+ 的辅助作用下能够使α-酮基羧酸脱羧, 进而与醛类发生缩合反应, 生成手性α-羟基酮类化合物。丙酮酸脱羧酶是一种底物范围广, 反应速度快, 合成效率高, 产物具有高度立体选择性的生物催化剂, 在合成制药工业上有重要用途。David[19] 等人分别利用乙醛、 丙醛、 2-呋喃醛、 3-呋喃醛、 2-噻吩甲醛和 3 -噻吩甲醛等与丙酮酸反应, 成功地得到了对应的α-羟基酮类化合物。
4.2 生物转化合成手性药物
生物转化合成手性药物其本质是利用微生物细胞内的酶催化非天然有机化合物的生物转化。该方法是利用氧化还原酶、 羟化酶、 合成酶、 裂解酶、 水解酶、 缩醛酶等催化的不对称合成反应， 将化学合成的前体转化为结构复杂的手性醇、 醛、 酮、 胺、 酸、 酯、 酰胺等衍生物[20] 。 4.2.1氧化反应
血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂最初是作为降压药研制的， 近年来， 其适应症扩大至心力衰竭、 急性心肌梗死、 动脉粥样硬化性血管疾病、 糖尿肾病的治疗[21] 。Ceranopril是一种血管紧张素转化酶抑制剂， 它的合成需要苄酯基- L-羟基赖氨酸作为手性中间体 。Hanson 等人首先用 Provi-dencia alcalifaciens 细胞将 N- ε- 苄酯基- L- 赖氨酸氧化脱氨生成相应的酮酸， 酮酸再用 L- 羟基异己酸脱氢酶催化生成苄酯基- L- 羟基赖氨酸， 反应产率可达到 95%， 光学纯度高达98. 5%， 反应中 NADH 的再生是通过甲酸脱氢酶来完成的 [22] 。 .4.2.2 缩合反应
他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶 A(HMG- CoA)还原酶抑制剂， 在他汀类药物前体合成中利用来自大肠杆菌的 5- 磷酸脱氧核糖醛缩酶(DEAR)可以催化一连串的醛缩合生成一种化合物， 该化合物可以为不同的他汀类药物合成提供侧链的手性中间体。但来自与大肠杆菌的这种酶的催化效率不是很高， 经过酶活性和序列的筛选方法， 从基因组文库中获得了一种新型 DERA 使化合物5 光学纯度 ＞99. 9% [23] 。 4.2.3酯解反应 恩替卡韦(entecavir， Baraclude)是一种鸟嘌呤核苷类似物对乙肝病毒具有抑制作
用。恩替卡韦三磷酸盐能抑制病毒多聚酶(逆转录酶) 的所有 3 种活性:(1)HBV 多聚酶的启动;(2)前基因组 mRNA 逆转录负链的形成;(3)HBV 的 DNA 正链合成[24] 。手性单乙酸酯是合成恩替卡韦的关键性中间体， 经证实用来自于 P. cepacia 的脂肪酶 PS- 30 水解(1α， 2β， 3α)- 2-［ (苄氧基)甲基］ -4- 环戊烯- 1， 3- 二醇二乙酸酯可以得到该中间体， 产率为 75%， 光学纯度是 98. 5%。同样利用脂肪酶 PS- 30 水解(1α， 2β， 3α)- 2- ［ (苄氧基)甲基］ -4- 环戊烯-1， 3- 二醇可以得到相应的乙酸酯产率 80%， 光学纯度为 98% [25] 。
5.总结
两种生物催化制备手性化合物的方法：消旋体的拆分和潜手性化合物的不对称合成。微生物或酶催化不对称合成( 也称生物催化合成) , 能高度立体选择性地制备手性化合物。选择性生物催化合成已成为合成手性化合物的最有意义方法之一，但是不对称化学合成方法也有一定难度, 反应步数较多, 要使用价昂的对映体试剂( 二磷配体与铱、铑、 钌的络化物等) 。
生物法拆分可以直接利用微生物(微生物法)，也可将酶自微生物细胞中分离出来再利用(酶法)。可以利用一个酶或一系列酶的催化作用，在后一种情况，通常无需将几种酶分离，而是利用整体细胞，即所谓的微生物法。其实质仍是酶法拆分，因为真正起作用的是酶。酶催化发展空间巨大，未来的前景不可限量。生物拆分法的优点：① 种类多，可催化的反应范围广。生物催化剂催化的反应通常具有高度的立体专一性。因此, 得到的产物旋光纯度很高, 适于作各种生物活性和药理试验; ②副反应少, 产率高, 产品分离提纯简单;③反应条件温和(常温、常压，pH值接近中性)，可简化工艺，降低设备投资与生产成本 ④生物催化剂无毒, 易降解, 对环境友好, 适于工业化大规模生产。