【案例】3
患儿，半岁，女。以突然发病出现发热、水样腹泻和呕吐等症状于2012年11月5日急诊入院，询问病史患儿为早产1个月，人工喂养，体检轻微脱水症，蛋花样粪便，体温38℃。患儿起病急，出现发热、水样腹泻和呕吐等症状，发病时间为深秋，体检轻微脱水征，蛋花样粪便。
【讨论题】你作为检验人员，如何进行采样并进行实验室检验确诊？
答：根据患儿表现出的症状（发热、水样腹泻、呕吐、蛋花样粪便）以及患病时间（深秋季节），高度怀疑为患儿感染了轮状病毒（rotavirus）；但是从患儿轻微脱水症来看，患儿可能同时感染了肠道腺病毒（enteric adenovirus）；虽然根据症状细菌感染的概率较小，但同时还应该考虑到一些常见细菌的感染，例如：致病性大肠杆菌、沙门菌、志贺痢疾杆菌、空肠弯曲菌等
1、采样：
对患儿近期所食奶粉、奶瓶、患儿粪便、患儿血液、患儿近期接触物品、与患儿接触人群的手进行采样（对近期所食奶粉、奶瓶、患儿近期接触物品、与患儿接触人群的手进行采样检测可以确定患儿感染途径，对患儿粪便和血液进行检测可以确诊引起患儿症状的原因）
1.1婴儿奶粉采样：利用无菌钥匙取30g奶粉于无菌采样袋中，密封； 1.2奶瓶：洁净棉拭子采样法； 1.3患儿粪便：用采样杯采集婴儿新鲜粪便，避免尿不湿吸附影响检测结果。于0度冰箱冻存，及时检测；
1.4患儿血液：普通真空采集管采集患儿足跟血； 1.5患儿近期接触物品：洁净棉拭子采样； 1.6与患儿接触人群的手：洁净棉拭子采样。
注：采集样本时应注意交叉污染，并做好唯一标记，样本采集完后立即消毒洗手
2、样品前处理：
奶粉:xxg奶粉加xxml无菌温水溶解均匀
将采集样品用生理盐水溶解或稀释，然后做致病性大肠杆菌、沙门菌、志贺痢疾杆菌、空肠弯曲菌的培养
3.实验室检测
3.1致病性大肠埃希菌
样品前处理
以无菌操作量取检样25mL,加入装有225mL营养肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠),振荡混匀。
增菌
将制备的样品匀液于36℃±1℃培养6h。取10μL,接种于30mL肠道菌增菌肉汤管内,于42℃±1℃培养18h。
分离
将增菌液划线接种MAC和EMB琼脂平板,于36 ℃±1 ℃培养18h~24h,观察菌落特征。在MAC琼脂平板上,分解乳糖的典型菌落为砖红色至桃红色,不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色;在EMB琼脂平板上,分解乳糖的典型菌落为中心紫黑色带或不带金属光泽,不分解乳糖的菌落为无色或淡粉色。
生化试验
1 选取平板上可疑菌落10个~20个(10个以下全选),应挑取乳糖发酵,以及乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落,分别接种TSI斜面。同时将这些培养物分别接种蛋白胨水、尿素琼脂(pH7.2)和KCN 肉汤。于36℃±1℃培养18h~24h。
2 TSI斜面产酸或不产酸,底层产酸,靛基质阳性,H2S阴性和尿素酶阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI斜面底层不产酸,或H2S、KCN、尿素有任一项为阳性的培养物,均非大肠埃希氏菌。必要时做革兰氏染色和氧化酶试验。大肠埃希氏菌为革兰氏阴性杆菌,氧化酶阴性。
3 如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统,可从营养琼脂平板上挑取经纯化的可疑菌落用无菌稀释液制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。
3.2志贺痢疾杆菌
1.增菌培养：用无菌吸管吸取样液5ml加到装有45mlGN增菌液的广口瓶中，37度培养6-8小时
2.分离培养：取增菌液一环分别接种于HE/SS和MAC平板，37度培养18-24小时.可疑菌落：SS/HE平板上为无色菌落（宋内志贺菌迟缓发酵乳糖出现粉红色菌落）HE平板上出现蓝绿色菌落
3.革兰染色镜检--取上述可疑菌落镜检。革兰阴性无芽孢杆菌（红色）；氧化酶实验--阴性选择上述菌落进行生化试验：
4.初步生化：挑取单个可疑菌落2-3个分别接种于KIA斜面和葡萄糖半固体培养基上，37度培养18-24小可疑菌落：KIA--分解葡萄糖、不分解乳糖、产酸不产气、不分解硫化氢， MIU--无动力
5.血清学试验（试探性血清凝集）：1）4种志贺菌多价血清检查
2）A1、A2、B、D群多价血清分别试验
6.进一步生化反应：生化反应套组，37度培养24-48小时 符合则检出。
3.3沙门菌
1 预增菌
无菌操作称取25g(mL)样品,置于盛有225mLBPW 的无菌均质杯或合适容器内,以8000r/min~
10000r/min均质1 min~2 min,或置于盛有225 mLBPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打
1min~2min。若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需调整pH,用1 mol/mL 无菌NaOH 或
HCl调pH 至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶或其他合适容器内(如均质杯本身具有无
孔盖,可不转移样品),如使用均质袋,可直接进行培养,于36 ℃±1 ℃培养8h~18h。 如为冷冻产品,应在45 ℃以下不超过15min,或2 ℃~5 ℃不超过18h解冻。 2 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1mL,转种于10mLTTB 内,于42 ℃±1 ℃培养18h~24h。
同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36 ℃±1 ℃培养18h~24h。 5.3 分离
分别用直径3mm的接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(或HE
琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板),于36℃±1℃分别培养40h~48h(BS琼脂平板)或18h~24h
(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板),观察各个平板上生长的菌落,各个平板 上的菌落特征见表1。
表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平沙门氏菌 板 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕BS琼脂 色;有些菌株形成灰绿 色的菌落,周围培养基不变 蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心HE琼脂 黑色或几乎全黑色 菌落呈粉红色,带或不带黑色中心,有些菌株可呈现大的带光泽的黑色XLD琼脂 中心,或呈现全部黑色 的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心 沙门氏菌属显色培 按照显色培养基的说明进行判定 养基 5.4 生化试验
5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于
底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于36 ℃±1 ℃培养
18h~24h,必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结果见表2。GB4789.4—20164
表2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果
5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水(供做靛基质试验)、
尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接 种。于36 ℃±1 ℃培养18h~24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存
于2 ℃~5 ℃或室温至少保留24h,以备必要时复查。 表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 硫化氢靛基pH7.2氰化钾赖氨酸反应序号 (H2S) 质 尿素 (KCN) 脱羧酶 A1 + - - - + A2 + + - - + A3 - - - - +/- 注: +阳性;-阴性;+/-阳性或阴性。 5.4.2.1 反应序号A1:典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异
常,按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。 表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
5.4.2.2 反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性,但
需要结合血清学鉴定结果进行判定。 5.4.2.3 反应序号A3:补做ONPG。 ONPG 阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙
门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
5.4.2.4 必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。 GB4789.4—2016 5
表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别 项目 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ 卫矛醇 + + — — + — 山梨醇 + + + + + — 水杨苷 — — — + — — ONPG — — + — + — 丙二酸盐 — + + — — — KCN — — — + + — 注: +表示阳性;—表示阴性。 5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据5.4.1的初步判断结果,从营养琼脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。
3.4空肠弯曲菌
1.样本处理
2.增菌 Bolton 肉汤预增菌，微需氧36 ℃±1 ℃培养4h Bolton 肉汤增菌，微需氧42℃±1℃培养24h ~48h
3.平板接种取适量增菌液 接种在skirrow 与mccd 琼脂平板，或显色培养基 42℃±1℃培养24~48h 。挑取平板上可疑菌落，接种哥伦比亚血琼脂平板 42℃±1℃ 培养24~48h 4.形态观察形态观察
挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检 5.4.1.3 动力观察
挑取可疑挑取可疑菌落用 1 mL mL mL 布氏肉汤悬浮，用相差显微镜观察运动状态布氏肉汤悬浮， 5.氧化酶试验
铱接种环或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶试剂润湿的滤纸上，如果在氧化酶试剂润湿的滤纸上，如果在 10 s内出现紫红色、紫罗兰或深蓝色为阳性。 6. 微需氧条件下25 ℃±1 ℃生长试验 挑取可疑菌落，接种到哥伦比亚血琼脂平板上，微需氧条件下 25 ℃±1 ℃培养 44 h±4 h ，观察细菌生长情况。 7.有氧条件下42 ℃±1 ℃生长试验
挑取可疑菌落接种到哥伦比亚血琼脂平板上，有氧条件下，42 ℃±1 ℃培养 44 h±4 h ，观察细菌生长情况。
3.5轮状病毒和肠道腺病毒
取粪便进行轮状病毒和肠道腺病毒的检测（电镜直接观察检测、抗原检测、核酸检测等），但是考虑到时效性、经济性和易行性选择抗原检测（ELISA法检测轮状病毒抗原、ELISA法检测轮状病毒抗体、免疫层析法等），采用德国R -Biopharm 公司的轮状病毒和腺病毒双联免疫层析快速检测试剂条（该法灵敏度和特异性均高达99%）可以快速准确的确诊引起患儿症状的是否为轮状病毒和肠道腺病毒。
4、预期结果：
对患儿标本进行细菌培养，未见可疑菌（致病性大肠杆菌、沙门菌、志贺痢疾杆菌、空肠弯曲菌等）生长，采用德国R -Biopharm 公司的轮状病毒和腺病毒双联免疫层析快速检测试剂条对患儿血液标本和粪便标本进行快速检测结果均只有轮状病毒为阳性，肠道腺病毒检测结果为阴性，可以确诊为是由轮状病毒感
染引起患儿症状，并出具检测结果报告单。