1.4 超临界流体色谱法仪器
以超临界流体作流动相的色谱仪器称为超临界流体色谱仪，它与气相色谱仪和高效液相色谱仪类似，同样包括流动相、净化系统、高压泵、进样系统、色谱柱、检测器和数据处理系统。长期以来，SFC仪器一直处于实验室自制水平，直到20世纪80年代才逐渐有商品化仪器。SFC仪器主要包括三个组成部分（图 1-10所示）：输送系统，其功能为在超临界压力下输送流动相；精密的恒温箱，保证系统的恒温性；控制系统，以实现超临界压力或密度等变化及色谱柱柱温温度调节等。高压流体（如二氧化碳）由气源流经净化管及热平衡装置后，进入二氧化碳高压泵，然后和有机改性剂混合，经过热平衡进入进样阀，样品由进样阀导入系统，然后经色谱柱分离后进入检测器，最后经过阻力器，整个系统由计算机控制。
图 1-10 填充柱SFC仪器示意简图
它与气、液色谱的主要区别是
a) 超临界流体色谱仪必须装有阻力器（或备压调节器）。它的作用是对系统维持
一个合适的压力，为使流体在整个分离过程中始终保持在超临界流体状态；另一方面通过它使流体转换为气体，实现相的转变。当使用氢火焰离子化检测器时，阻力器应放在检测器之前（以保证色谱柱的出口压力缓慢地降至常压）。使用其他（能承受高压的）检测器时，阻力器可放在检测器之后，如紫外检测器。为防止高沸点组分的冷凝，阻力器一般应维持在300-400℃。 b) 色谱柱应有精密的温控系统，以便为流动相提供精确的温度控制。
c) 整个SFC色谱仪器都处在足够的高压下，只有这样才能使流动相处于高密度状
态，以提高洗脱能力，因此，超临界色谱仪必须有精密的升压控制装置。 d) 当使用极性较弱的超临界流体（如二氧化碳）作为流动相，在分离分析极性化
合物或相对分子量高的化合物时，常需加入甲醇、乙腈等有机改性剂，以改善流动相对极性样品的溶解能力，扩大流动相样品的适用范围。
e) 由于有机改姓剂的加入和流体流速对分离效果影响明显，因此要求输送系统具
有较高的精密度，用以保证色谱分离的重复性。 因此SFC仪器要求的操作条件很高，对仪器各部件的制造和连结都提出了新的要求。早起的理论或应用研究中，SFC设备多由实验室改装气体色谱仪或液相色谱仪而成，目前已有多钟商品化的SFC仪器问世。例如用HPLC进行改装时，只要在原有设备基础上添加高压进样器和压力控制系统，并根据需要选择合适的高压检测器，即可将HPLC改装成简易的填充柱SFC。因为SFC在高压状态下操作，因此改装时必须解决好压力控制问题，既要使流体在系统中保持超临界状态，又要防止管线堵塞和泄露。商品化的SFC有Berger公司的SFC系列、Agilent公司的1200 SFC系列和Waters公司的UPSFC系列等。与之前的通过HPLC仪器组装的SFC仪器不同，现代SFC仪器越来越注重仪器的整体化，通过整体设计(系统体积小)，色谱柱技术的改进（色谱柱颗粒小），能使色谱分离在一个梯度条件下，不仅基线噪音极低，而且重复性好、峰形窄、峰宽一致。 1.4.1 流动相输送系统
流动相输送系统或为高压泵系统，是SFC的关键部件，对泵的要求便于SFC的最佳化操作。具体要求：无脉冲输送；泵体较大；能够精密控制压力和流量；具有线性或非线性压力密度程序；适于超临界流体。目前在应用上有注射泵和往复泵，在该系统中，还有二氧化碳增压器和泵的程序控制。对于室温常压为气体的流动相，可将高压钢品中的流动相减压至所需压力或用升压泵增压。对于室温常压为液体的流动相，通常采用无脉动注射泵输送。
在毛细管SFC中，由于所需流量很低，大都采用注射泵。其优点是无脉冲，泵体大于
150 mL，充液一次可用几天，耐压性好，基本上符合泵的设计要求，因此被广泛推荐使用。缺点是其泵体有时需要冷却，更换溶剂时清晰困难，无法进行梯度（如加改性剂）冲洗。 当前LC中广泛使用的输液泵是往复泵，不仅易于操作，可快速该换溶剂，无限输送溶剂，而且可采用双泵系统，一泵输送流动相，另一泵加改性剂，进行梯度洗脱。但往复泵不能直接输送液体二氧化碳，需要对泵体加以改装，并用冷冻剂将泵头冷至-8℃，才能输送液体二氧化碳。还有采用二氧化碳增压器，即增加液体二氧化碳的头压就可在室温下注入注射泵。国外都以氦气充入二氧化碳钢瓶，国内多以氢气代替氦气制成二氧化碳钢瓶，效果很好。一般是在二氧化碳钢瓶瓶嘴下，焊一根不锈钢管，直插瓶底，装进二氧化碳后，接氦气或氢气钢瓶。
在SFC中注射泵、往复泵的控制参数，通常是压力而不是流量。泵的流出压力一般由计算机控制。以设定点压力与世纪压力进行比较控制流出压力。实际压力是由泵出口处的压力传感器得到的，控制系统能控制流动相的压力或密度程序。密度程序是由有关流动相的压力及温度与密度的关系，通过一定算法而得到的，然后用密度作为控制参数。 1.4.2 进样系统
一般来说，LC的进样器，都适合于SFC的仪器，特别是对填充柱SFC，可用类似于LC的进样器。但毛细管SFC因其进样量很小，要求进样器的内管体积小，进样速度快，故常用分流进样法进样。通常采用四通、六通进样阀。在分流进样中也存在样品“失真”的问题，应特别注意。
1. 手动注射阀
LC用的定量管体积为10 μL的六通进样阀也常用，采用半填充法，进样量为0-10 μL，重复性良好，这种阀无论接细孔径填充柱直接进样，还是由分流三通接毛细管柱进样，重复性和柱效都令人满意，在进样体积较大时，还可采用预柱浓缩样品，提高柱效。
2. 气动转动注射阀
Lee Scientific公司600型SFC/GC及Carlo Crba SFC-3000系列都采用气动转动注射阀，这种阀设计新颖，可在注射位置停留一定时间，然后快速回到采样位置，定时进样可由停留时间的长短控制进样量1-500 μL。快速复位使进样真正达到脉冲进样，从而达到提高柱效的效果。
a) 定时分流注射阀
定时分流注射器如所示，这种阀由10 MPa 氢气压力驱动，阀内管体积为0.2 μL，停留时间为若干毫秒，由微机控制。进样时由注射头打进样品，过量样品由废液容器收集，按动注射开关，阀在注射位置停留一定时间后，很快复位，就可打进纳升样品。大部分经分流阻力器或开关阀放空，小部分进石英毛细管柱进行分离。分流与进柱流速比即为分流比，一般控制在（6-20）：1或更大些。分流比可由测量分流阻力器及柱后阻力器出口处的流速来测定。定时分流注射定量分析的定量重复性很好。
b) 不分流注射阀
可将毛细管柱直接插到进样阀的底部，在瞬间注入极小量的样品，因此可用不分流注射阀进样。不分流进样阀的定量重复性经试验也是令人满意的。 1.4.3 色谱柱管理系统
一般GC色谱炉可以满足需要，但也有些较特殊的问题。
1. 低容量双柱双流路色谱炉
一般炉腔较大，便于安装色谱柱及阻力器，检测器插件能够容纳多重检测器。炉子两侧留有接MS、FTIR等的接口。
2. 多级温度程序
在SFC中由于柱温随组分的保留作用很复杂，故在不同的温度区间，要求不同的温度控制程序，在低温区（<100℃）组分的保留值随柱温增加而增大，故对宽沸程样品分析，要求有负的温度程序，即在程序降温下进行分析。而在较高的温度区（>100℃），组分的保留随柱温增加而降低，则要求用程序升温进行分析。
3. 温度的稳定性
因为超临界流体的密度是与柱温直接有关，故要求柱温控制精度要高，保证温度的稳定性。
4. 安全保护
在使用超临界流体n-C5时，如有渗漏，当炉子加热丝变红时，就会引起爆炸，故要求炉丝设计，在最高温度时，电热丝不产生橘红色，并注意安全保护。 1.4.4 阻力器
为使超临界流体在整个色谱柱分离过程中始终保持为流体状态，当用FID、NPD、FPD、MS时，在色谱柱出口和检测器之间，需要一个阻力器（或称备压调节器），以保证色谱柱的出口压力缓和地降至大气压，当用紫外、荧光检测器时，因其本身可在高压下操作，故可在检测器出口接阻力器降压，阻力器大致分为三类，即直管型、小孔型和多孔玻璃型阻力器。下面分别进行简单的介绍。
1. 直管型阻力器
直管型阻力器，是由一根内径5-10 μm石英毛细管组成，长度根据需要确定。这种阻力器结构简单，可由细管长度决定阻力大小。但非挥发性物质易凝结而使喷口阻塞，易产生毛刺而使样品“失真”。
2. 小孔型阻力器
小孔型阻力器，可以单独做成，亦可作为石英毛细管的一端，做成整体阻力器，使用方便，效果较好。
3. 多孔玻璃型阻力器
此种阻力器是由多孔二氧化硅烧结制成的，是Lee公司据专利生产的。在内径100 μm烧结玻璃（或陶瓷）构成。全长约20cm，一端由对接连接器与毛细管柱相连，另一端接FID，使用方便，效果好。 1.4.5 检测器
在超临界流体色谱中由于流动相具有惰性和流体性质，因此可接LC的光度检测器，而流体流出了色谱柱可减压成气体，故可接大部分GC检测器，尤其是氢离子火焰检测器。流动相这些特性，使GC和LC检测器在SFC中得以通用，使其可利用的检测器大为扩展。其中最重要的检测器是高灵敏度的通用型GC检测器FID，其次是LC检测器紫外和荧光检测器。实际过程中，检测器的选择要考虑不同的流体和检测方法的匹配问题。
1. 氢离子火焰检测器
氢离子火焰检测器（FID）因其死体积小、响应快，是接毛细管柱SFC的理想检测器。但是要作为SFC的检测器要求其稳定性更好、灵敏度再提高。由此Lee Scientific公司推出新的FID设计，采用新的筒状收集电极，力求把全部产生的离子收集下来，可以显著提高检测器的效率；采用废气防空限流法，使火焰稳定性提高，噪声降低。FID的检测限达
10-13g/s。为使满足超临界流体气化时大量吸热，使高分子物质气化，FID具有大的加热器，并保持在350-450℃。但FID属于破坏型检测器，有些场合并不适用。
2. 紫外和荧光检测器
紫外和荧光检测器是LC常用的检测器，它们在SFC中也很重要。当用正己烷、正戊烷等作流动相，或在超临界流体中添加改性剂梯度洗脱时，氢离子火焰检测器不能使用，只能采用紫外和荧光检测器。在SFC中，紫外和荧光检测器是非破坏型检测器，因此可以用来制备微量样品或制备色谱。
3. 其他检测器
氮磷检测器（NPD）是测定含氮有机物的选择性检测器，可用于药物及氨基酸分析。双火焰光度检测器（FPD）是一种高灵敏度、高选择性的测定有机硫和有机磷化合物的检测器。这种检测器能够消除大量烃类对测定硫和磷的干扰。射频等离子体检测器（RPD）是一种高灵敏度、高选择性的多元素光谱检测器，有很好的发展前景。微波诱导等离子体检测器、无线电频率等离子体检测器、及ICP检测器可用于金属有机化合物的检测，在SFC中也被广泛采用。电流检测器、电子捕获检测器及激光散射检测器等都作为检测手段在SFC中得到良好应用。
1.4.6 超临界流体色谱联用技术
色谱-光谱联用技术仍是当今较为活跃的研究领域，其中联用最多的包括SFC/MS联用、SFC/FRIT联用及SFC/NMR联用。
1. SFC/MS联用技术
色谱/质谱联用技术首先是由GC/MS联用发展起来的。MS对单一组分有很强的鉴别能力，但不适于多组分混合物的定性。相反，GC是一种高灵敏度的分析手段，但对物质的鉴别能力低于MS。所以将两者结合起来实行联用，正是扬其所长、避其所短的有效途径，从而可以取得在各自单独使用时无法得到的信息。MS使SFC/MS联用技术成为近年来强有力的分析手段之一，是分析热不稳定、高分子量物质的重要分析方法。
SFC像GC一样，与MS有共同之处：如色谱的分离与质谱的检测都是在气相进行，两者的灵敏度都很高，温度范围相当，样品量及最小检知量相接近。而且色谱的出峰速度与MS的扫描速度也能相匹配。因此， 联用时无须对两种仪器本身做任何改装。但两者之间存在着差异，如SFC是在压力条件下操作，而质谱是在真空条件下运转。而且，SFC的流出物量往往大于质谱的泵容量。所以，必须采用接口装置(interface)才能实现联用。 SFC/MS联用流程如图 1-11所示。此图左边是用液体色谱仪改装的超临界流体色谱仪，右边是质谱仪，通过直接液体引入(DLI)接口联接起来，即成为SFC/MS联用仪。显然，接口是实现联用的关键部件。联接装置的探针（Prole）中有一不锈钢隔膜，在隔膜中心用激光穿一小针孔（2.5～3.0 μm）。为了保持探针中流体的超临界状态，小针孔的尺寸是非常重要的。同时，探针必须恒温在流动相的临界温度之上。进入质谱仪的流量可部分地由反压调节器调节， 但主要是通过选择具有适当针孔尺寸的不锈钢隔膜进行控制。 在SFC/MS联用中，防止溶质在管壁上沉淀也是十分重要的。反压调节器后面的压力低于流体的临界压力，其中的流体已不是超临界流体，因而溶解能力显著下降，若出现沉淀会沉积于管壁而不能依次流出，显著影响分离效果。