析柱，可以根据被分离物质的大小进行分离。已有不同型号的葡聚糖凝胶用于不同物质的分离。当蛋白质混合样品随洗脱液向下流动时，比凝胶颗粒孔径大的蛋白质分子不能进入凝胶网格内，被排阻在凝胶颗粒的外部；比凝胶颗粒孔径小的蛋白质分子则能进入到网格内部。其结果是，分子大的蛋白质则随着洗脱液直接从柱上流出，分子比较小的蛋白质则因走了许多?弯路‖而被后洗脱下来。分子愈小，―弯路‖走得愈多，洗出的速度愈慢。根据这一原则，上述蛋白质混合物从SephadexG–50洗脱出的顺序是：b>c>a>d。
3-17解答：用凝胶过滤(即分子排阻层析)法先除去分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质，余留下来的低分子量的含酶的混合物再用离子交换层析法分离，于是就能获得所需要的纯酶。 习题:
1．延胡索酸酶催化延胡索酸水合形成苹果酸，其逆反应苹果酸脱水转变成延胡索酸也能被该酶催化吗？为什么?
2．△G'和△G两者与化学反应的关系是怎样的？
3．借助米-曼氏方程υ＝Vmax[S]/(Km＋[S])研究底物浓度对酶反应速度影响的一种有用的方法是，在规定的实验条件下检验这个方程。在下述条件下，方程呈什么形式？①当〔S〕=Km时；②当〔S〕>>Km时；③当〔S〕< 4．①为什么kcat / Km比值能用来测定一种酶对它不同底物的优先权？②什么是酶的kcat / Km上限？③ kcat / Km值接近上限的酶常被说成达到“完美催化”。请解释。 5．人类免疫缺于病毒Ⅰ(HIV-Ⅰ) 基因编码一种该病毒装配和成熟所必需的蛋白酶 －1－1 （Mr＝21500）。该蛋白酶能催化七肽底物水解，其kcat＝1000 s和Km＝0.075mol·L。(a) －1 当HIV-Ⅰ蛋白酶的浓度为0.2mg mL时，计算底物水解的Vmax；(b)当七肽的–CO–NH–替换成–CH2–NH–时，所得到的衍生物不能被HIV-Ⅰ蛋白酶水解，而却可以作为该酶一种的 －1 抑制剂。在如(a)所示的条件下，该抑制剂浓度为2.5μmol·L时，Vmax是9.3×10－3 mol·L－1－1 ·s。该抑制作用属于哪种类型？ 6．为了确定某酶的催化反应的初速度的底物依赖关系，制备了一系列的l00ml含有不同底物浓度的反应混合物。向每个混合物加入相同量的酶后便开始反应。通过测定每单位时间（分钟）所形成的产物量而获得催化反应的初速度，其结果如下表所示。 表4—2 底物 浓度 初速度 底物浓度 初速度 底物浓度 初速度 (mol/L) (μmol/min) (mol/L) (μmol/min) (mol/L) (μmol/min) 0 ? 1× －6 －6 －5 10 0.08 5×10 0.25 1×10 0.33 1×100.50 －4 0.48 1×10 －3 0.50 1×10 －2 ①把表中的数据绘制成图，在给出的酶量下的Vmax是多少? ②根据米-曼氏方程，用Vmax、υ和〔S〕推演出Km的代数表达式。计算每个反应混合物的Km。 Km值取决于底物浓度吗? ③当底物浓度为0.1mol·L和l×l0mol·L时，计算它们的初速度。 ④反应混合物保温2分钟后确定反应的初速度。当初始底物浓度为1×10mol·L时，计算产物的生成量。在2分钟后底物总量的百分之几被转换? 7．许多酶都表现出类似钟罩形的pH-活性依赖曲线。但是，不同的酶具有不同的活性最高点，即不同的最适pH。请你举例说明pH对酶活性影响的原因。 8．研究某抑制剂对单底物酶催化反应的影响，获得如下表的结果。 －2 －1 －1 －7 －1 ①该抑制剂是竞争性还是非竞争性抑制剂? ②在无抑制剂存在时，该酶促反应的Vmax和Km是多少? ③在有抑制剂存在时，该酶促反应的Vmax和Km是多大? ④该反应的抑制常数（Ki）是多少? 9．十烷双胺((CH3)3N—CH2—(CH2)8—CH2－N(CH3)3)，一种用于肌肉松弛的药物，是乙酰胆碱酯酶的可逆的竞争性抑制剂。通过增高乙酰胆碱的浓度可使抑制逆转或解除。十烷双胺共价地同酶结合吗？为什么这种抑制作用可通过增高乙酰胆碱的浓度而被解除? 10．二异丙基氟磷酸（DIFP）可使乙酰胆碱酯酶不可逆失活。但是，当有可逆抑制剂十烷双胺存在时，能延缓该酶的失活。为什么? 11．在底物以及中间物转换态同酶活性部位的结合中涉及哪些作用力？解释为什么底物同酶的紧密结合是于酶的催化无益的，而转换态的紧密结合则是需要的？ 12．当胰蛋白酶活性中心的Asp定点突变成Asn后，它的催化反应速度降低10 000倍。为什么？ 习题解答 1．解答：酶是生物催化剂，它通过降低进入转换态的活化能而增高反应速度，但不改变反应的平衡位置。由于正向和逆向过程都经相同的转换态，所以两者的速度均可被该酶促进。该反应总的自由能变化不会因有酶的存在而改变。但是，请注意，由于底物和产物所固有的自由能是不同的，因此由底物或产物进入到过渡态所需要的活化能的多少是不相同的。酶加快相反两个过程的速度也是不相同的。如果某过程进入的速度太 慢，实际上这个过程是不能进行的。 2．解答：△G'是某一反应在标准条件的产物与反应物所固有的自由能之差。当△G'是负值时，表明平衡有利于产物。但平衡不受任何催化剂的影响。有利的平衡并不意味着反应物 ? 转变成产物就能自动发生或能快速发生。△G是反应物从基态达到转换态（活化态）所需的能量，即活化能。若反应所需的活化能越低，反应的速度就越快。酶的存在能大大降低反应 0? 所需的活化能。反应的平衡与△G'有关，但反应的速度则与△G有关。 3.解答：①当〔S〕=Km时，υ＝Vmax[S]/(Km＋[S])＝Vmax/2。这个方程可作为Km的物理定义，即Km是初速度达到最大半反应速度所对应的底物浓度。 ②当〔S〕>>Km时，Km＋〔S〕可以近似地等于〔S〕。那么此时υ＝Vmax。因此，在底物浓度很高的情况下，初速度变成了零级反应，即初速度不依赖于底物浓度，并表现为最大反应速度。 ③当〔S〕< 4．解答：① kcat / Km比值是酶专一性常数或对不同底物的优先权的一种衡量。当两种底物以相同浓度竞争同一种酶的活性部位时，它们转变成产物的速度比值是与它们的kcat / Km比值相等的。由于对每种底物来说，反应速度υ＝（kcat / Km）[E][S]，而[E]和[S]又是相同的，所以kcat / Km比值大者的底物是酶优先选择的对象。 υ(S1)/υ(S2)＝（kcat / Km）1[E][S] /（kcat / Km）2[E][S] 0 0 ++ ② kcat / Km上限大约是10~10s。这是两个不带电荷的分子在生理温度下通过扩散相遇的最快速度。 ③一种酶的催化效率不能超过E和S形成ES复合物的速度，最有效率的酶的kcat / Km 值接近它通过扩散与底物相遇的速度。在接近这个极限速度下，酶催化反应的速度是最快的，因而可以成为有效的催化剂。 5．解答：(a)先计算酶的摩尔浓度，再计算Vmax [E]＝0.2gL(1 mol/21500g)＝9.3×10 mol·L Vmax＝kcat[E]T＝1000 s(9.3×10M)＝9.3×10 mol·L ·s (b)由于在抑制剂存在下Vmax不变，因此这是一种竞争性抑制。由于该抑制剂在结构上与底物相似，它与底物竞争同酶活性部位结合，因而降低酶的催化活性。 6．解答：①由题中给出的数据所作的图如下图所示。图解表明，当底物浓度升高到1－3－1－3－1 ×10mol·L以上时，初速度不再升高。因此断定，底物浓度超过1×10mol·L时， －1 酶被底物饱和，已达到最大反应速度，即对于该酶量的Vmax是0.50μmol·min。认识到Vmax取决于酶量是重要的，即如果该酶浓度增加，Vmax亦增大。 ②米氏方程可以改写： －1 －6 －3 －1 －1 －1 －6 －1 89 －1 那么在不同的底物浓度下，我们可以得到如下表的数据。重要的结论是，Km是这个具有特定底物的酶的特征性常数，它不取决于底物浓度。我们也能从图4—3获得该Km的值。Km是酶半饱和所需要的底物浓度，并且在半饱和下，初速度是最大反应速度的一半(Vmax /2)，这发 －6－1 生在5×10 mol·L的浓度下。 ④当〔S〕＝1×10mol·L时，反应初速度是0.50μmol·min -1 （即Vmax）。那么在两分钟内产物的生成量是0.50μmol·min×2min=lμmol。由于100ml反应混合物含有： －2 -1 －1 由于在2分钟后只有0.1％的底物被转化，〔S〕仍然大大地大于Km， -1 因此反应初速度仍是 0.50μmol·min。 7．解答：在酶促反应中，游离酶，底物以及酶底物复合物都可能受到环境pH的改变而影响它们的解离状态。在最适pH范围内，酶活性中心有关基团的解离与底物的解离可能处于最佳结合状态，酶活性中心有关基团的解离能最有效地发挥酸、碱催化效率或增强它们的亲核性或亲电性。 例如胰凝乳蛋白酶的活性中心的“电荷转接系统”，当环境处于中性时，16位的Ile的α-氨基质子化，有利于电荷转接系统的形成，使195位的Ser残基的侧链具有更大的亲核性，有利于对底物的攻击。而在碱性pH下，16位的Ile的α-氨基去质子化，破坏了电荷转接系统，降低了195位Ser残基的亲核性，酶的活性就会降低。 又例如，精氨酸酶的最适pH为9.5—9.9，在该pH范围内，底物精氨酸解离带正电荷，而精氨酸酶的活性部位则解离成带负电荷。这样有利于酶与底物的结合。 - 8．解答：应用双倒数作图法先将题中的数据换算成倒数，得到如下表的结果。 以1／υ对1／[S]作图得到如下图的曲线。