王小小：电镜技术在动物病毒检测中的应用
电镜技术在动物病毒检测中的应用
王小小
（甘肃农业大学动物医学院 预防兽医系 兰州）
摘要：对于常见动物病毒的检测，常使用的方法是血清学检测、生物学接种及病原分离等。但对于一些新生疫病的检测，尤其用血清学检测时，由于手中不一定具备与该疫病相对应的抗体，往往不能马上进行检测。为了及时控制和扑灭新生疫病，必须尽快地确定病原。电子显微技术问世及其在病毒检测中的应用解决了这一难题。本文在国内外学者研究的基础上，就应用电镜技术检测动物病毒过程中的取样部位及时间、制样方法、电镜下病毒的识别方法及常见病毒的形态特征和鉴别要点进行归纳总结，为同行们使用电镜技术检测动物病毒提供一定的理论基础。
关键词：电镜技术，动物病毒，取样，制样，检测
前言
已有学者应用电镜技术对形态特征性强的动物病毒（如正粘和副粘病毒、
正痘和副痘病毒、疱疹病毒、轮状病毒、弹状病毒、冠状病毒及腺病毒等）感染的动物病毒病进行了诊断[1]。尤其对于混合感染的和新发现的病毒病的检测，电镜技术优于优于其他任何一种方法[2]。虽然常规的血清学特异性诊断是比较快速和准确的,但一次只能检出一种病原,且对于新生疫病,当手头上不具备相应的血清时,更是束手无策[3]。若使用电镜进行检测,凡在病料中有什么样的病原就能检出什么病原。因此，对病料的取样部位及时间、制样方法、电镜下病毒的识别方法的探索，对于使用电镜技术检测动物病毒具有一定的理论意义及现实指导意义。
1.病料的取样部位及时间[2,3]
要想获得高检出率，病料的取样部位及时间是关键。取材应根据各种病毒
在动物体内分布的位置特点来确定，采集相应的组织或在特定部位取材,且要力求准确。例如，鸡传染性法氏囊病病毒采取感染鸡的法氏囊粘膜层，猪传染性胃肠炎病毒最好取感染仔猪的小肠粘膜层等。如取材的组织或部位不当,则很难观察到病毒。另外所采集的样品尽量以最快的方式送往实验室。取材时间应根据观察目的而定,一般在感染中期容易发现病毒，但也有的病毒（蓝耳病病毒）在感
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染的初期也能较容易地找到病毒。
2.样品的制备方法[3,4,5]
为了提高检出率,并能够在电镜下快速地定位目标病毒，进而准确地诊断出病毒病。需在镜检前对所采集的样品进行一定的处理。
目前所用的样品处理方法以哈尔滨的李成报道的系列方法最为常见。该系列方法包括离子交换捕捉法、改进微波幅射制样法、高速离心法和免疫胶体金标记法。其中离子交换捕捉法是浓缩病毒的方法,具有防腐保鲜作用,其浓缩样品的程度相当于超速离心法，简便易行，适用于远距离运送样品（如动物粪便及实质脏器病料）的检测；微波幅射改进法，不但加快了包埋制样速度，而且也提高了包埋质量；高速离心沉淀法快速简便，提高了检出率，适用于检查接毒的鸡胚尿囊液及细胞培养物或冻干疫苗毒；免疫金标法不但提高了检出率，而且对于非典型及形态特征性不强的病毒粒子也能作出准确的诊断。
3.电镜下的病毒识别[3,6,7]
电镜下病毒的识别,也是病毒检测的关键步骤。此过程要求检测者具备扎实的电镜操作技能和丰富的病毒形态学知识及观察经验。
观察时一般可从以下几方面分析：（1）病毒形态结构的同一性和可复性。也就是说在观察某个病毒时，若在视野中反复出现同样的形态结构，就该注意寻找其基本特征，如副粘病毒大小和形态是多样性的，但总的说来还是有一定的规律性。在超薄切片上可看到该病毒粒子内部有小圆环样或细管样结构，这就是该病毒核衣壳横断面和纵断面。在负染色样品上观察该病毒表面有密集而整齐的突起物，这就是该病毒的纤突结构。（2）从病毒结构看。根据病毒衣壳排列方式，可将病毒分为正二十面体及螺旋对称结构。裸病毒及正二十面体的核衣壳等，于宿主细胞内或纯化后的病毒粒子特别容易形成晶格排列，这就像同样形态、大小的玻璃球在盘中不论怎样摇动，静止时都会形成点阵排列一样。而有囊膜病毒粒子，由于其大小形态不一样，就不能形成晶格排列。此点也能帮助确定病毒一定范围。（3）病毒囊膜的有无，纤突的长短和形态等，如冠病毒的纤突像瓜籽样倒长在囊膜上，同时排列也非常整齐，形如花冠。（4）病毒在宿主细胞分布情况以及合成、装配部位、成熟方式等都是鉴别的指标，如DNA病毒都在宿主细胞核内复制与装配，RNA病毒几乎绝大部分是在细胞浆内复制、装配、成熟。
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4.常见病毒的形态特征和鉴别要点[7,8,9]
4.1正痘与副痘病毒
痘病毒有的呈砖形,大小为220～450nm×140～260nm×140～260 nm；有的呈卵圆形,大小为250～300nm×160～190nm。在超薄切片上可见典型病毒粒子的中央有亚铃形的核心,在核心中间两侧凹陷处有侧面小体。核心被双层外膜包裹。负染样品可见病毒粒子表面除有双层外膜外,在副痘病毒粒子上往往看到绳索样结构以若干个“8”字型缠绕成线团状外观，如图1所示；正痘病毒粒子表面附有短棒样结构,呈桑葚样外观，如图2所示。
4.2正粘和副粘病毒
正粘病毒粒子的直径为80～120nm, 其形态多为球形及长杆形(丝状体),有的丝状体长达1μm以上,在初期分离培养物中尤为多见。病毒的核衣壳呈螺旋
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图1 西伯利亚蝗痘病毒超微结构 图2 痘病毒电镜照片 图3 流感病毒 图4 麻疹病毒 王小小：电镜技术在动物病毒检测中的应用
对称型,较规整地盘绕在粒子中。病毒囊膜上的纤突长为10～14nm,直径为4～6 nm,排列也较规整，如图3为流感病毒电镜照片。副粘病毒体积大小不等,形态不规则,病毒核衣壳在粒子的排列似乎呈随机盘旋,囊膜上的纤突长为8～12 nm,其排列也不像正粘病毒那样规整，如图4所示。在超薄切片上可见到囊膜内病毒核衣壳的各种断面,呈微管样或小圆环样结构。
4.3小RNA病毒与小DNA病毒
小RNA病毒直径约为30 nm(22～30 nm),小DNA病毒直径约为25 nm(18～26 nm)。两种病毒均为正二十面体,无囊膜,分空心和实心粒子,易形成病毒结晶体。其主要区别在于小RNA病毒在宿主细胞浆内装配,而小DNA病毒在宿主细胞核内装配,通过超薄切片法可将两者区分。小RNA病毒和小DNA病毒分别如图5及图6所示。
图7 冠状病毒结构模式图8 冠状病毒透射电镜照片 图5 小RNA病毒 图6 犬细小病毒 4.4冠病毒与类冠病毒
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国际病毒分类委员会将这两种病毒分入同一病毒科。这两种病毒在形态结构上非常相似，都具有大而稀疏的纤突附着在囊膜上，貌似花冠，如图7所示。但类冠病毒的纤突不像冠病毒排列得那样整齐,有时可看到2～3层或多层纤突,粒子的大小也不一致,并呈多形态。在超薄切片中,类冠病毒的核衣壳呈手镯样结构；冠病毒核衣壳则呈轮胎样结构，如图8所示。
4.5疱疹病毒
分为裸体病毒(未成熟粒子)和有囊膜病毒(成熟粒子)。未成熟粒子直径为100～110nm,拟核形态有双环型、十字架型、马蹄型、长杆型、致密芯子型等。成熟病毒粒子可分小囊膜病毒和大囊膜病毒。小囊膜病毒直径为150nm左右,分布在宿主细胞核的空泡内、核周及核膜间隙。大囊膜病毒直径约为200nm或更大,在囊膜与衣壳间有非常厚的皮质部分，如图9所示。该粒子分布在宿主细胞浆的空泡内、内质网小池及细胞外间隙。
4.6腺病毒
病毒粒子的直径为80～110nm,没有脂蛋白囊膜,衣壳为典型的正二十面体,呈5:3:2对称排列,壳粒数为252个,每个壳粒直径为8～9 nm。在二十面体的12个顶部为中空五角形的五邻粒,以五邻粒的基部往往可看到射出1根或2根宽2nm、长16～25nm带有顶球的纤维突起,呈放射状。其余的240个壳粒位于二十面体的面和棱上,为中空六角形的六邻粒,由这些壳粒构成衣壳,包裹着40～50nm的核心，其结构图如图10所示。在超薄切片中可看到在宿主细胞核内形成
图9 疱疹病毒 图10 腺病毒结构模式图 5