干洗剂对蚕豆根尖的遗传毒理性研究
一、实验目的：
研究干洗剂对蚕豆根尖的遗传毒理性效应 二、实验原理：
利用蚕豆根尖微核技术研究四氯乙烯细胞遗传毒性和污染效应。蚕豆根尖细胞微核技术(Viciafaba—root tip cellsmicr0nucleus test．VAMCN)作为一种快速有效的环境保护检测系统和遗传毒物预警系统，目前在水环境、日常生活用品和重金属等污染检测方面的应用研究较多，但在评价干洗剂对细胞遗传毒理和污染效应方面的研究未见报道。
生活中，有些不耐水洗的衣服及质料只能用干洗。其实干洗并不是完全“干”的，一般是用挥发性干洗剂，洗后再回收干洗剂，但衣服仍保持干燥。这种干洗剂绝大多数用过氯乙烯（PERC，亦称四氯乙烯），因它洗涤力强，易购得，几乎是“标准”干洗剂。而且还用于金属除脂剂及生产其他化学品。
美国科学院于2010年2月初发表公告，认为：①PEC很可能是对人致癌剂。这意思是说，它对人致癌虽尚无肯定的证据，但已有强有力的证据。它致动物产生各种癌是有明确证据的。②除致癌外，它最危险的作用是对神经及大脑损伤。对在饮水中及空气中安全水平应定在远远高于可致神经损伤的水平。
由于四氯乙烯存在毒副作用，我国就干洗业采用的四氯乙烯干洗剂制订了相关标准，要求干洗用四氯乙烯达99.5%的浓度，干洗车间内四氯乙烯的最高容许浓度为200mg/m3，不允许将用于工业清洗的四氯乙烯用于干洗衣服。同时，禁止干洗店采用易漏气的开启式干洗机，要求在干洗过程中充分回收四氯乙烯，将毒副作用降到最低。
本实验应用蚕豆根尖微核技术探讨干洗剂对蚕豆根尖细胞的生态毒理，以此评价干洗剂的遗传毒性和污染效应，旨在为监测评价干洗剂及其残留对环境的污染和维护人体健康与生态系统安全提供理论依据．同时也为蚕豆根尖微核技术的发展和完善提供借鉴材料。 三、实验器材与试剂： 1、材料：蚕豆
2、试剂：⑴染毒剂：干洗剂 ⑵其它试剂：改良石碳酸品红（配方见下）、蒸馏水、无水乙醇、冰醋酸、1 mol·L-1
的盐酸（解离剂跟书上的配方不一样）
3、器材：⑴培养：培养盆、滤纸、针筒、50mL量筒、青霉素空瓶、500mL烧杯、玻棒、标
签纸、刀片、一次性塑料杯、1ml 移液枪
⑵制片：针筒、滴瓶、标签纸、双凹版、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、擦镜纸、
吸水纸、显微镜、(水浴锅)、培养皿
试剂配制 ① 卡诺氏固定液：无水乙醇:冰醋酸=3：1 （现配先用） ② 70%乙醇保存液：用无水乙醇和蒸馏水配制（现配先用） ③
④ 改良石碳酸品红溶液（见遗传实验课本P243） ⑤ 1 mol·L-1 盐酸 （同改良石碳酸品红）
⑥ 染毒剂配制梯度：用干洗剂和蒸馏水配制如下梯度 0(原液)、10-4、
20-4、40-4、80-4、100-4用自来水做对照。（预实验后在具体确定？）
四、实验步骤： 1蚕豆根尖培养 ⑴浸种、催芽：
选择颗粒饱满、大小均匀的蚕豆种子用自来水在室温条件下浸泡24 h(水要浸没种子，中间换自来水两三次)，再将其放入铺有滤纸的培养盆中（水不用太多，能保持水分就好），然后置于室温下进行培养(期间注意补水、换水，把烂掉与不发芽的种子处理掉、并及时补充培养种子。由于最近温度较低，晚上放室内培养)。 ⑵染毒：
等到根长长至1 cm左右时，分别选取10粒生长比较一致、初生根发育良好的种子移入盛有0(原液)、10-4、20-4、40-4、80-4 、100-4（四氯乙烯微溶于水，大约要10000倍，相关实验用量都是0。1 ul，所以到时候预实验最好做的跨梯度大一点）和自来水共6个干洗剂浓度处理的一次性塑料杯中染毒（预实验即是确定染毒时间:设有四个时间段分别是4h、8h、12h、16h；干洗剂溶液刚好浸没蚕豆初生根)，还要记录染毒前后根尖的颜色变化。然后再恢复培养24h。 ⑶根尖细胞固定： 切取根尖1 cm左右置于青霉素空瓶中，加现配卡诺氏固定液固定24 h，然后用70％乙醇在冰箱中保存备用（也可固定24h后直接镜检）。 ⑷解离：
（参照我们遗传第二个实验 《多倍体诱发和鉴定》中的洋葱根尖解离）取固定好的根尖用蒸馏水浸洗干净，然后用针管吸干残余水分。再把根尖放入盛有1 mol·L-1 盐酸的双凹板中解离10-15min左右直至根尖软化（具体时间预实验注意观察）。最后取出根尖用蒸馏水洗净残余盐酸并吸去多余水分。 ⑸染色压片
取解离后的根尖放入双凹板中滴加改良石碳酸品红的染色10-15min后置于载玻片上。滴上蒸馏水，盖上盖玻片压片。
⑹镜检
每张片子选取五个视野，每个视野观察10个细胞，记录观察到微核的细胞数和染色体畸变的细胞数。 五、预期结果：
1) 有毒理学效应的情况： 试剂浓度 0 10-4 20-4 40-4 80-4 100-4 自来水
2）结果分析
观察细胞数（个） 5*10 5*10 5*10 5*10 5*10 5*10 5*10 有微核细胞数 （个） 染色体畸变细胞数（个） 用统计学方法处理数据，分别统计微核率MCN％、和染色体畸变率CAF％。计算如下：
MCN％=(观察到的微核数／观察细胞总数)×100％
CAF％=(染色体畸变数／分析的染色体总数)×100％