四、实验步骤
1、酪氨酸标准曲线的绘制
按表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液 试剂（ml） 蒸馏水 100μg/ml酪氨酸 酪氨酸最终浓度（μg/ml） 管号 1 10 0 0 2 8 2 20 3 6 4 40 4 4 6 60 5 2 8 80 6 0 10 100 测定步骤：在275nm下测定各管的吸光度，以酪氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2、蛋白酶活力测定
粗酶液制备：用2 层纱布过滤摇瓶发酵液，4500 rpm 离心15 min，取上清液（粗酶液）测蛋白酶活力。
a．取5mL用pH 8.0硼酸缓冲液制备的0.6％酪蛋白溶液于试管中，40℃预热2min后加以pH8硼酸缓冲液稀释的酶液(即取l mL蛋白酶摇瓶发酵液，加19mL缓冲液) l mL，40℃准确反应10min后，立即加5mL0.4mol／L三氯乙酸以终止反应，沉淀残余底物，40℃保温20min，使沉淀完全，用漏斗加滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定275nm的光密度。
b．另以先加三氯乙酸使酶失活、后加酪蛋白的试管，按上述同样步骤测定光密度，作为空白对照。
3、酶活力定义：以lmin内由酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm的光密度与1μg 酪氨酸相当时，其所需要的酶量为1个单位。
酶活力(U／mL)＝O.D(酶)×n／10×O.D(酪)
式中：10＝反应时间10min；O.D(酪)=lμg／mL的光密度；n=酶液稀释倍数。 五、思考题
实验中的酶活力检测是否出现负结果?如有，请分析原因?