等。
（3）多倍体植物一般生活力强，对环境适应性亦强，抗旱、抗寒以及抗病虫害等优势明显。仅从植物地理分布上看，多倍体大多出现在高纬度、高海拔以及北极、沙漠等气候环境变化剧烈的地区，说明植物多倍体不利自然条件的适应能力比二倍体强。通过多倍体育种可提高林木的抗逆性，由此扩大树种的栽培条件与种植范围。如四倍体柳杉的耐寒性增强；三倍体欧洲山杨比较耐干旱瘠薄，更适宜于条件较差的山地栽植，且抗病能力较强；三倍体桦木对锈病的抗性增强等。 5.8.1体细胞染色体加倍
体细胞染色体加倍是人类最早选择获取多倍体的途径。研究表明，机械损伤、高温和低温、辐射、化学试剂等理化处理方法均可获得体细胞多倍体。然而由于细胞分裂的不同步性，很难做到使所有处理的细胞染色体加倍，因此最终获得的大多是混倍体或嵌合体，影响了倍性优势的发挥。迄今只有四倍体刺槐等几个品种在生产上成功应用，大多因生长等表现欠佳，主要用作为育种的研究材料。 5.8.2不同倍性体间杂交
当一树种中存在可育的不同倍性体时，利用不同倍性体杂交是获取新的异源或同源多倍体（autopolyploid）最为简捷而有效的途径。Nilsson-Ehle(1938)最早用三倍体(triploid)与二倍体（diploid）欧洲山杨杂交，获得了一些三倍体、四倍体（tetraploid）和混倍体植株。利用三倍体与二倍体杂交之所以能够获得多倍体，是由于三倍体不规则的减数分裂可以产生少量不同倍性可育配子的缘故。通过不同倍性体间杂交，成功获得多倍体的树种有：三倍体杨树、桑树、桦木、刺槐、枸杞等。Einspahr等(1984)、Weisgerber等(1980)利用四倍体欧洲山杨与美洲二倍体山杨杂交获得了异源三倍体山杨，为杨树纸浆材新品种选育做出了贡献。
目前，有关研究多限于群体中存在天然多倍体或已经获得人工多倍体的树种，这主要是因为树木生长周期长，即使多倍体诱导成功，还要等待开花结实，需时较长。况且这种多倍体还必须具的较好的育性，在与另一亲本交配时应表现出较高的配合力等，否则不能取得杂交后代，或虽有子代，但无优势。 5.8.3未减数配子杂交
杨树是利用天然2n花粉直接培育多倍体的主要树种。国外在灰杨、香脂杨、黑杨杂种等杨树中均发现有天然2n花粉，并用这些花粉授粉得到了三倍体。朱之悌院士等(1995)利用毛白杨天然2n花粉与毛新杨、银腺杨杂交，最终获得了26株生长、材质俱优的异源三倍体，这些三倍体已经得到大面积推广。但这种2n花粉由于受树种自身的遗传因素和外部环境的双重影响，产生具有偶然性、多变性，且2n花粉比率较低，因此其利用也受到限制。
人工诱导配子染色体加倍是林木多倍体诱导最快捷的途径。Johnsson(1940)最早采用秋水仙碱处理欧洲山杨、美洲山杨雄花枝，取得了一些2n花粉，然后给雌花授粉，均得到了三倍体植株。此后在欧洲山杨、美洲山杨、美州黑杨、香脂杨、银白杨、毛新杨、银腺杨、橡胶、桑树等树种中，通过秋水仙碱或高温诱导2n雌雄配子，并用与正常异性配子杂交，
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得到了三倍体植株。
在通过花粉染色体加倍途径进行白杨三倍体育种时，即使采用比率较高的2n花粉杂交，三倍体的实际诱导得率也极低，难以获得可供选择的育种群体。这主要是因为白杨2n花粉较正常花粉萌发迟缓，在参与授精过程中竟争能力差的缘故。为了降低单倍性花粉参与受精的竞争力，可采取纯化方法，提高2n花粉的比例，如使用600目金属网筛对混合花粉进行筛选等，但很难做到绝对纯化，尤其在比率较低时更难做到。此时，利用花粉倍性对辐射敏感性（radiation sensitivity）差异，施加一定剂量的Ｃo-γ射线辐射以刺激2n花粉萌发，同时抑制或杀死部分单倍性花粉，能够在一定程度上提高柱头上萌发和萌发较快的2n花粉比率，增进其参与授精的竟争力，从而大幅度提高三倍体诱导得率。
体配融合 毛 白 杨 体细胞加倍 四倍体 四倍体 体细胞加倍 其它杨树 天然种群 种或杂种 选择 选择 雌配子加倍 优良株系 2n配子 2n配子 ♀或♂ ♀或♂ 花 选择 花 粉 粉 人 2n花 人 工 粉高 单倍配子 单倍配子 工 加 产雄 ♀或♂ ♀或♂ 加 倍 株 倍 2n花粉 2n花粉 三倍体与二倍体混合杂种后代 测 基 定 因 鉴定 林 库 三 倍 体 测定、选择 二倍体 优良三倍体无性系
造 林 60
图5－3 三倍体毛白杨诱导途径及其育种程序（康向阳，2002）
5.8.4胚乳培养与细胞融合
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在大多数被子植物中，一个精核与两个极核融合完成双受精过程，从而产生三倍性的胚乳，因此通过某一树种的胚乳培养（endosperm culture）也可以获得三倍体植株。1973年，Srivastava首次由罗氏核实木的成熟胚乳培养中获得了三倍体胚乳再生植株。此后胚乳培养研究进展迅速，林木胚乳培养主要集中在猕猴桃、枸杞、枣等经济树种，取得了三倍体苗木。由于愈伤组织继代培养中往往会产生染色体变异，使再生植株多为非整倍体（aneuploid）、混倍体，甚至恢复为二倍体，是目前胚乳培养的主要问题。
细胞融合（somatic cell fusion）能够获得同源或异源多倍体（alloploid）以及双二倍体（amphiploid），可以说是克服植物远缘杂交障碍、创造多倍体的又一条新途径。1960年，Cocking发明了用酶去除植物细胞壁获得原生质体的方法,为植物细胞杂交奠定了基础。此后，随着原生质体化学融合和电融合技术的发展，已有近百种种内、种间和属间原生质体融合获得了再生植株，甚至可以实现体配细胞融合与再生。林木中的细胞融合主要集中于杨树等树种，有关研究仍处于实验室探讨阶段。 5.9林木染色体加倍的方法 5.9.1化学诱导
化学诱导法是指利用生物素等某些化学试剂处理分裂中的植物器官、组织甚至细胞，从而诱导细胞染色体加倍的方法。细胞学观察表明，植物微管蛋白受秋水仙碱等化学物质处理后，形成纺锤丝，并使收缩机制受到抑制，造成正处于分裂阶段的细胞被阻止在中期而不能进入分裂后期，从而形成染色体数加倍的核。
染色体加倍时应根据育种目标选择适宜的处理材料。如果是为了取得同源偶数倍性体，可选择萌动的种子、幼苗、茎尖、幼胚、合子（zygote）、愈伤组织等，其中以合子、幼胚和刚萌动的种子最佳。其主要原因是这些材料包含的分裂细胞较少，不易出现嵌合体，容易见效。如是为了取得奇数倍性体，则应处理进入减数分裂中的雌雄花芽，通过染色体加倍处理获得未减数配子，再与正常减数配子杂交选育多倍体。
染色体化学加倍除选用秋水仙碱外，萘嵌戊烷（C12H10）、有机杀菌剂富民隆、氧化亚氮（N2O）等也常被使用。处理方式有：①浸渍法：用一定浓度的秋水仙碱等化学试剂浸渍萌发的种子、幼苗、茎尖、花芽等。②注射法：用注射器将一定浓度的秋水仙碱等化学溶液直接注射到待处理的部位。一些树木的花芽适合用此方法。③涂布法：将含一定浓度的秋水仙碱等化学溶液的羊毛脂软膏涂抹在生长点上。④喷雾法：将配制好的秋水仙碱等化学药剂喷到要处理的分生部位。⑤药剂-培养基法：将待处理材料接种到含一定浓度秋水仙碱等化学试剂的培养基上进行处理的方法。幼胚、愈伤组织以及一些较小的种子适合采用该种方法。许多的研究表明，在化学诱导染色体加倍过程中需重视如下几个方面：
（1）处理时期：由于秋水仙碱等化学药剂只影响正在分裂的细胞，所以在处理时要了解被处理植物的细胞分裂周期，从而保证在细胞分裂有效作用时期之前进行处理。掌握最适处理时期，可取得事半功倍的效果。据康向阳（1999）的研究，杨树花粉染色体加倍的最佳处理时期为减数分裂粗线期，此时施加0.5%秋水仙碱溶液处理，最高可以获得85%以上的2n花粉。
（2）试剂的最适浓度：因处理的材料、选择的处理方法以及处理的持续时间和环境温
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度等而异。一般而言，敏感材料（如根）采取直接浸泡或注射、处理持续时间长、环境温度高时，浓度宜较低；而当材料相对不敏感、采取涂布、喷雾等方法、处理持续时间短或环境温度较低时，浓度宜较高。秋水仙碱化学诱导采用的浓度一般为0.01%～0.5%，处理时间在12～72小时。
（3）处理持续时间：因处理的材料、选择的处理方法以及环境温度等而异，一般在12～48 小时之间。处理的持续时间必需适度，如处理时间太短，则往往只有少数细胞染色体加倍，此时未加倍的细胞在生长、分裂速度方面较加倍细胞快，加倍细胞的生长增殖受到抑制，处理无效；反之，如处理时间过长，超过一个细胞分裂周期，则处理结果是染色体数目增加不止一倍，而形成更高的倍性细胞，或者因细胞受到秋水仙碱等化学试剂的毒害而引起细胞死亡，甚至导致组织或植物个体死亡。
（4）处理适宜温度：温度过高和过低均不利于多倍体诱导。低于10℃时，因低温能抑制细胞分裂，从而影响化学药剂的作用效果；大于25℃，药剂对细胞的毒害作用加剧，导致细胞活力降低、甚至发生细胞裂解等。一般处理温度以15～20℃为宜。另外，处理温度与处理的溶液浓度和持续时间密切相关，一般温度低时浓度可稍大、处理时间可较长；温度高时须降低溶液浓度，缩短处理的持续时间。 5.9.2物理因素诱导
物理诱导法是指利用温度、射线、机械损伤等物理因素处理植物材料，诱导细胞染色体加倍的方法。在树木中最成功的例证是Mashkina等(1989)的工作，他们将花粉母细胞处于不同发育阶段的欧洲赤松与几种杨树的雄花枝置于恒温箱中，高温处理诱导花粉染色体加倍，在杨树中取得了高达94.4％的2n花粉，并用2n花粉杂交得到了三倍体杨树。虽然物理诱导在大多情况下的诱导得率比较低，但由于其操作简单、费用低、一次可以处理大批材料等，仍被经常采用。
物理诱导法对象包括萌动的种子、幼苗以及雌雄花芽等。其中，温度处理可采取连续高温、连续低温或高低温交替处理等方式。高温处理范围为38～45℃；低温处理范围为0～4℃。处理时间因植物材料而异，一般高温处理在2～8 h；低温处理在12～72 h等。电离射线（如α射线、β射线、γ射线等）或非电离射线（如紫外线等）辐射处理因材料而异，处理以长时间、低剂量为宜。 5.9.3林木多倍体的鉴定
林木等植物材料在施加染色体加倍处理后，是否获得多倍体需经过倍性鉴定。鉴定方式可分为间接与直接鉴定两种，其中直接鉴定最为可靠，即通过体细胞或花粉母细胞染色体压片，检查材料的染色体数目，如果染色体数目呈倍数增加，则可以判定获得了多倍体植株。然而，当处理材料很多时，对每株均进行染色体观察是一项费时、费力的工作。此时最好先根据多倍体的巨大性特点，从形态和生理特性上判别，这就是间接鉴定。树木天然多倍体一般首先是因为它们高大，叶片异常肥厚而被发现的，然后通过新叶芽压片进一步确定染色体数目。当处理材料具有叶大而厚、叶色深、花大、气孔及花粉增大等特征，可初步判定是倍性体植株。如三倍体毛白杨苗期叶与长枝叶巨大，当年生苗的叶片宽度最大可达53cm。
思考题
1．试以杂交育种的实例，用所学遗传学知识来讨论杂交的作用和机理。
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2．什么是杂交育种，应包括那些步骤？为什么说取得杂种只是杂交育种工作的起点？ 3．亲本选择中应考虑哪些因素？其理由何在？试从遗传学加以讨论。 4．花粉和杂交技术中包括哪些内容？每一内容中的技术关键是什么？ 5．试述室内杂交和室外杂交的异同，各适用于那些树种？ 6．提高杂交可配型有哪些方法？
7．试比较介绍的两种杨树育种程序，你认为哪种更合理些,为什么？ 8．树种繁殖方式不同，在鉴定、选择和推广等做法上有何异同？ 9．试从区域化试验来讨论品种的含义。 10.多倍体诱导的途径有哪些？ 11.试述林木多倍体育种的意义。
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