机能实验学实验设计报告
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人指甲对慢性化脓性中耳炎的药用价值
2017 年 11 月 15日
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实验内容： 一、立题理论依据及研究现状。 理论依据：根据《草医草药简便验方汇编》中所述，人指甲（煅存性），冰片少许，共研细粉。用时先将耳道洁净，后吹药粉。可治慢性化脓性中耳炎。 在某一偏方中也有说将人指甲烤干后磨粉，然后掺入一定比例的白矾。用时将耳道洁净，后吹药粉。 从以上依据可知，人指甲对慢性化脓性中耳炎有一定的药用价值，但其科学性有待考察。 研究现状：针对慢性化脓性中耳炎，王冰和许珉在国际耳鼻咽喉头颈外科杂志中表示，慢性化脓性中耳炎与细菌生物膜密切相关。他们认为低毒力的细菌或病毒感染是分泌性中耳炎的重要致病因素，而细菌生物膜的形成和发展包括调节膜的形成、细菌可逆性附着、细菌繁殖、细菌播散5个过程，可通过屏障作用、生物膜特殊的微环境、耐药表型的表达对抗机体免疫、密度感应系统等多种方式导致抗生素耐药，从而导致慢性感染迁延不愈或反复性发作。通过对患者的分泌液进行培养，发现最主要的致病菌为金葡萄菌和铜绿假单胞菌。故针对慢性化脓性中耳炎的治疗方面提出假设：通过抑制细菌的黏附，破坏保护性基质、脂质体包裹抗生素穿透生物膜的目的，从而对慢性感染的治疗提供新的突破。 二、主要研究内容及实验过程。 1、实验对象、性别、规格、数量 健康豚鼠70只，雌雄不拘，体重250-300g。所选豚鼠均为耳廓反应灵敏，电耳镜检查可见鼓膜完整，光锥清晰，排除外耳道、鼓膜、中耳等感染。 2、仪器与药品 仪器：笼子、电耳镜、试管、注射器、生化培养箱、方形滤纸 试剂：铜绿假单胞菌落、3%戊巴比妥钠溶液、生理盐水、人指甲粉末、白矾粉末、冰片粉末、氧氟沙星洗耳液 3、实验步骤 （1）将豚鼠分为七组，分别进行编号（1-7）放置于鼠笼中。 （2）制备豚鼠的慢性化脓性中耳炎模型。取真空保藏铜绿假单胞菌菌种活化24h后，取一个单菌落于盛5mlMH肉汤培养液的试管中，35℃静止培养12h左
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右，取3ml转入盛150mlMH肉汤培养液的锥形瓶中，35℃、120r/min振荡培养12h.制成菌悬液，并将此菌轻液作为母液。采用边配制边测定的方法，用MH肉汤培养液作对照溶液，用光程为1cm的立方石英比色杯校准其线，然后依次2倍稀释加母液的MH肉汤培养液，测定其OD值。“陈寅儿”经过实验，测算出波长在585mm时，铜绿假单胞菌菌液浓度与OD值之间关系的间归方程式为 Y=0.0711X+0.5018.式中Y为OD值，X为菌液浓度，基本单位为108CFU/ml.本实验所需菌液浓度为1.0x106CFU/ml。当X等于1时，其菌液浓度为1.0x108CFU/ml,对应的OD值为0.5729.我们计算最接近此OD值时母液的稀释倍数，将母液用PBS稀释同样倍数并再稀释100倍，所得到的菌液浓度即为1.0x106CFU/ml,4℃冰箱保存备用。 所有豚鼠腹腔注射3%的戊巴比妥钠溶液35-50mg/kg实施全身麻醉，用75%酒精6消毒双侧外耳道。用1ml无菌注射器抽取1.0*10CFU/ml铜绿假单胞菌菌液，接5号半腰椎穿刺针，在光纤电耳镜的直视下，经鼓膜紧张部后下象限穿刺，向鼓室内注射，每侧各100μl菌液。 （3）向1组豚鼠耳中吹入人指甲粉末，2组豚鼠吹入白矾粉末，3组豚鼠吹入冰片粉末，4组豚鼠吹入人指甲和白矾的混合粉末，5组豚鼠吹入人指甲和冰片的混合粉末，6组豚鼠向耳中滴入氧氟沙星液，7组豚鼠不作处理。前6组豚鼠均一日两次。（暂时以此剂量，最佳剂量可通过预实验调整） 具体如下表所示： 试剂 剂量 组别 第一组 第二组 第三组 第四组 第五组 第六组 第七组 指甲 白矾 冰片 指甲+白矾 指甲+冰片 氧氟沙星 3mg 3mg 3mg 3mg 3mg 3滴 （4）对7组豚鼠进行观察并记录数据。 4、观察指标 3
鼓膜炎症状念评分标准如下表所示： （1） 0分: 正常，无炎症表现 1分: 轻度充机，伴轻度内陷 2 分: 中度充血，伴中度内陷或凸起，并有轻度中耳积液 3 分: 重度充血和内陷，并有中到重度的中耳积液 4 分: 鼓膜穿孔并流脓 （2）进行听阈测验，检验其传导性耳聋的严重程度。 三、实验研究的技术路线 制定课题 指甲 白矾 冰片 指甲+白矾 指甲+冰片 氧氟沙星液 不作处理 制作豚鼠慢性化脓性中耳炎模型 正式实验 做预实验，检验可行性 制定实验计划 收集、查找资料 分析结果 4 对豚鼠进行观察 对各个豚鼠的恢复情况进行记录 四、预期实验结果 （1）若4、5、6组豚鼠治愈所需的时间相同或比6组所需时间短（说明4、5、6号所使用的试剂效果相当或比抗生素效果好） （2）若在（1）成立的条件下，1、2、3组所需时间较长甚至与7组一般长短（说明1、2、3号所使用的试剂对慢性化脓性中耳炎无效） （3）若1、2、3、4、5在6组豚鼠痊愈后仍未痊愈而与7组豚鼠所需时间相当甚至比7组豚鼠情况更严重（说明1、2、3、4、5所用试剂无效甚至会加重感染） （4）若1、4、5、6所需时间相同或1、4、5所需时间少于6组，而2、3组所需时间较长但也能痊愈（说明人指甲粉起主要的作用，且与抗生素效果相当或更好） （5）若2、3、4、5、6组所需时间相当或2、3、4、5组所需时间少于6组而1组所需时间与7组相当（说明人指甲粉的作用不大或无效，而冰片或白矾的效果比抗生素好） 五、可行性分析 （1）实验所需仪器、试剂以及实验动物不难获得。 （2）该动物模型已有前人使用过并成功使用。 （3）在正式实验之前，会进行预实验然后及时调整正式实验中可能出现的问题。 综上所述，实验可行。 六、统计学分析 用SPSS17.0进行随机区组设计的方差分析方法进行检验；通过对处理组和区组的数据处理得到P值，然后推断药物对总体的影响。 七、可能遇到的问题及解决方案 （1）进行实验的时间不恰当导致实验结果误差大；多次观察，确定进行实验的最佳时机。 （2）操作不熟练，在麻醉时或制作豚鼠模型时导致大鼠死亡或大鼠状态不佳影响实验结果；故在实验之前需要练习直到能够熟练的操作。 （3）在实验时细菌对抗生素产生了耐药性导致抗生素效果不佳而影响实验结果。暂时未想到解决方案，若出现这种情况应该需要重新实验然后换用新的抗生素。 （4）试剂剂量把握不好，导致实验结果不佳。故在做预实验时认真调节好最佳的剂量，及时调整。 （5）在实验中豚鼠因为不明原因死亡。故需分析豚鼠死亡原因并重新实验。 （6）豚鼠耳朵过小不易将粉末喷入中耳内。可尝试使用注射器喷入。
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指导教师意见（对设计性实验研究方案、实验过程等方面的意见）。 指导教师：_____________ 年 月 日
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