脓汁和粪便标本中病原微生物的检测
[摘要]通过革兰氏染色并在油镜下观察细菌形态结构、细菌的生化反应和细菌的血清学反
应等手段区别和鉴定脓汁标本中和粪便标本中细菌，检测病原微生物，并进行细菌药物敏感性试验。
[关键词]脓汁标本、粪便标本、分离培养、革兰氏染色、细菌生化反应鉴定、细菌动力
学试验、细菌血清学试验、细菌药物敏感性试验
前言
医学微生物学检查的目的是通过病原体的分离鉴定及检测病人的免疫应答等，以达到对传染性疾病做出病原学诊断，并根据实验室检查结果进行合理的药物治疗与防护。临床的标本常含有很多杂菌，必须进行分离和纯化。常见的化脓性病原菌有葡萄球菌，链球菌脑膜炎球菌等。脓汁标本在做细菌分离培养的同时，均需直接涂片检查，观察是否有典型形态的菌体、芽孢有无，为临床提供最初诊断。粪便标本中常含有很多杂菌，应根据检验目的菌的不同而选择培养基，尽可能抑制杂菌，以利于病原体的检出。通过革兰氏染色并在油镜下观察细菌形态结构、细菌的生化反应和细菌的血清学反应等手段可以区别和鉴定细菌的种类。细菌药物敏感性实验可以防止细菌产生耐药性和确保治疗效果，同时也为细菌种类的鉴别提供了佐证。
1.材料与方法
1.1培养基制备
1.11材料
天平、称量纸、药勺、干粉培养基、酒精灯、三角烧瓶、量筒、试管、试管架、5ml吸管、吸头、棉塞、标签纸、牛皮纸、皮筋
1.12方法
称取一定量的肉汤培养基，至于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，煮沸一次，趁热分装；称取一定量的营养琼脂培养基，至于三角烧瓶中，加入适量的蒸馏水，煮沸三次（煮至刚刚冒泡，立刻置于台面，半分钟后再煮），使完全溶解，趁热分装。（平板培养基：以无菌操作，倾注平皿10ml，琼脂完全凝固后，平板倒放，4℃冰箱保存备用。斜面培养基：培养基趁热斜放，培基不超过试管长度的2/3，琼脂凝固以后，4℃冰箱保存备用。）贴上标签后灭菌使用。
1.2细菌分离培养
1.2.1材料
脓汁标本、粪便标本、普通营养琼脂培平板、伊红美蓝琼脂平板、接种环、酒精灯
1.2.2方法
接种前，接种环烧灼灭菌。取标本在平板表面上方密集涂布5～10 mm2。烧掉接种环上多余的标本。冷却后，应用分区划线分离法，将脓汁标本接种于营养琼脂平板（2份），粪便标本接种于伊红美蓝平板（2份）。接种完毕后，接种环烧灼灭菌。将平板倒置37℃培养18～24h,观察结果 。
1.3细菌的群体生长特性观察和纯化培养
1.3.1材料
接种环、酒精灯、细菌分离培养物、斜面培养基
1.3.2方法
①观察细菌分离培养物中菌落特征，并记录。
②选取平板上相同的菌落数多的，典型的，容易挑取的单菌落。通过无菌操作轻刮取菌，接种于斜面培养基中。接种完毕，灼烧接种环，斜面培养基置于37℃培养过夜。
1.4细菌的个体形态特征的观察
1.4.1材料
斜面培养物、营养肉汤、生理盐水2支、镜油瓶、拭镜纸一套，吸水纸1本，载玻片、结晶紫染液（第1液）、芦戈氏碘液（第2液），95%酒精（第3液），稀释石碳酸复红（第4液）、染色架
1.4.2方法
①斜面培养物的观察
②革兰氏染色：取洁净载玻片，用灭菌操作后的接种环取生理盐水1-2环于玻片上，挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹匀。待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回2-3回合，使标本固定，进行染色。结晶紫染液初染1分钟后水洗，芦戈氏碘液媒染一分钟后水洗，95%酒精脱色20-30s，水洗，稀释复红复染一分钟后水洗。待标本凉干后滴加香柏油，油镜下观察。 ③通过无菌操作，分别在斜面培养物中挑取菌苔少许，立即移入肉汤培养基管中，在接近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤调和，使菌液混合语培养基中，混匀。接种完毕，试管口通过火焰2-3次灭菌，塞好棉塞。接种环灼烧后放下。
1.5.细菌的糖发酵实验
1.5.1材料
粪便标本分离菌、接种针、小砂轮、葡萄糖发酵微量管、乳糖发酵微量管
1.5.2方法
通过无菌操作，用灭菌接种针刮取新鲜细菌培养物少许，分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内。将微量管平放在平皿内，37℃培养过夜后观察结果。
1.6血浆凝固酶实验
1.6.1材料
脓汁标本分离菌、兔血浆、生理盐水、载玻片
1.6.2方法
取干净玻片一张，用记号笔一分为二，其中一格加兔血浆1-2滴，另一格加生理盐水1滴。将接种环在酒精灯火焰上灼烧灭菌冷却后，取细菌新鲜培养物少许，在生理盐水中研磨混匀成细菌悬液。用灭菌接种环取细菌悬液1环，或挑取细菌培养物少许，在兔血浆中轻轻抹匀。稍等片刻，观察结果。
1.7血清学实验
1.7.1材料
福氏志贺菌诊断血清、载玻片、粪便标本分离菌
1.7.2方法
取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul，用接种环分别取粉红色菌苔，约2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀。载玻片来回倾侧，让菌液充分混匀，凝集速度更快、结果更清楚。
1.8半固体穿刺培养
1.8.1 材料
半固体培养基、接种针、酒精灯、粪便标本分离菌
1.8.2 方法
接种针灭菌处理后挑取菌苔少许，垂直刺入半固体培养基中心，可刺达近底管处，但不要到达管底，然后沿原路退出。接种完毕，试管口迅速通过火焰2-3次灭菌，塞好棉塞。接种针灼烧后放下。37℃培养过夜。
1.9细菌药物敏感性试验
1.9.1材料
脓汁标本肉汤培养物、粪便标本肉汤培养物。MH琼脂平板、青霉素、链霉素、庆大霉素药物纸片，尺子
1.9.2 方法
接种环取菌液3～5ul×2次,在平板培养基表面，拉出2条细菌接种线，使呈“十字形”。平板密集划线接种细菌。设计三点，呈等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、
链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，镊子火焰灭菌。37℃18～24小时培养，观察结果。
2结果
①脓汁标本在普通平板上有黄色、白色两种菌落，菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明。粪便标本在伊红美蓝平板上，有紫黑色、淡粉红色两种菌落。紫黑色菌落具有金属光泽、大而隆起、不透明。淡粉红色菌落半透明，直径1～2mm。
粪便标本平板 脓汁标本平板
②用伊红美蓝平板,从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。显微镜下，均为G-杆菌，散在排列。用普通平板，从脓汁标本中分离得到黄色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状。
G+球菌 G-杆菌
③粪便标本分离菌糖发酵试验中，紫黑色菌落菌种的葡萄糖和乳糖微量发酵管都为黄色，有气体产生；粉红色菌落菌种的葡萄糖微量发酵管为黄色，不产气，乳糖微量发酵管无明显变化。
④脓汁标本分离菌血浆凝固酶实验中，黄色菌种菌液出现明显凝块，实验结果为阳性；白色菌种未出现明显凝块实验结果为阴性。
⑤玻片凝集试验中，粉
红
色菌落菌种出现片状凝集现象，实验结果为阳性；紫黑色菌落菌种实验结果为阴性。
⑥半固体培养基中，紫黑色菌落菌种扩散生长，培养基呈扩散云雾混沌状态；粉红色菌落菌种沿穿刺线生长，穿刺线边缘整齐，周围培养基清澈透明。
脓汁和粪便标本细菌检测结果
标本 菌落 形态 血浆凝固酶试验 葡萄糖发酵试验 乳糖发酵试验 半固体培养基动力学试验 血清学实验 黄色 脓汁标本 白色 G+球 + — G+球