海洋微生物生物表面活性剂的发酵生产研究进展
摘要：生物表面活性剂一般是由微生物产生的一类两性分子的表面活性物质。与化学表面活性剂相比,微生物合成的表面活性剂拥有生物降解、环境友好、耐极端环境和低毒性等特点。本文综述了海洋微生物发酵生产生物表面活性剂的微生物源、发酵机理、发酵条件和产物分离技术等方面的研究进展，并简要介绍了其工业应用前景。 关键词：海洋微生物;生物表面活性剂;发酵
微生物在一定条件下培养时，在其代谢过程中分泌产生的一些具有一定表/界面活性，集亲水基和疏水基结构于一分子内部的两亲性化合物，称为生物表面活性剂(Biosurfactants)[1]。它们的分子结构主要由两部分组成：一部分是疏油亲水的极性基团，如单糖、聚糖、磷酸基等；另一部分是由疏水亲油的碳氢链组成的非极性基团，如饱和或非饱和的脂肪醇及脂肪酸等。和传统的化学合成表面活性剂相比，生物表面活性剂不仅因合成过程及原料简单在成本上占优势，而且在本身物理化学性质如表面活性、界面活性和破乳性等方面也有明显的优势[2]。此外，生物表面活性剂还具有无毒、能生物降解等优点[3]。生物表面活性剂的这些特性尤其适合于石油工业和环境工程，如石油的生物降粘、提高原油采收率、重油污染土壤的生物修复等。另外，生物表面活性剂作为天然添加剂，在食品工业、精细化工、医药和农业等工业方面也愈来愈受到人们的青睐。随着人们崇尚自然和环保意识的，增强，生物表面活性剂将有更加广阔的应用前景，并有可能成为化学合成表面活性剂的替代品或升级换代品[4]。
生产生物表面活性剂的微生物广泛分布于海洋、淡水水域、地下水、土壤、沉积物、淤泥及一些极端环境中(高盐地、储油库等)。海洋占地球表面的70%，使得海洋微生物成为生物表面活性剂的重要来源[5]。 1生物表面活性剂的分类及其来源的海洋微生物
生物表面活性剂主要分为糖脂类、脂肽和脂蛋白类、磷脂和脂肪酸类、聚合表面活性剂类和微粒表面活性剂类等五大类。 1.1 糖脂类
糖脂类生物表面活性剂是研究得最多的生物表面活性剂之一，主要由糖基连结长链脂肪酸或羟基脂肪酸[6]。糖脂按分子中亲水部分所含糖营的个数分为单糖脂、双糖脂、多糖脂等。在糖脂中，人们最熟悉的是鼠李糖脂、海藻糖脂和槐糖
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脂[1]。生产糖脂类生物表面活性剂的海洋微生物有产碱杆菌(Alcaligenes sp)、节杆菌(Arthrobacter)、食烷菌(Alcanivorax borkumensis)、红球菌(Rhodococcus)、盐单胞菌(Halomonas)及未鉴别的海洋细菌MM1[5](表1)。
表1 糖脂类生物表面活性剂生产菌及其产物活性
生产菌名称 产碱杆菌(Alcaligenes sp) 节杆菌(Arthrobacter) 食烷菌(Alcanivorax borkumensis)
红球菌(Rhodococcus) 盐单胞菌(Halomonas) 未鉴别的海洋细菌MM1
1.2 脂肽类
产物特性
抑制微鞭毛虫和微藻的生长 表面活性剂活性、乳化
表面活性剂活性 增强对多环芳烃的溶解度
乳化 表面活性剂活性
脂肽类表面活性剂是一种公认降低界面张力能力最好的一类小分子生物表面活性剂。脂肽类生物表面活性剂一般是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的代谢物，它的亲水基为多肽，疏水基为长链脂肪酸，两者以酰胺键和内酯键相连[3]。
一种脂肽往往是多种异构单体组成的混合体，由于脂肽中的脂肪酸链长和支链数量以及氨基酸的组成具有多变性，致使脂肤表面活性剂的种类繁多。具有代表性的脂肽有surfactin、lichenysin、fengycin、iturin、mycosubtilin及bacillomycin等。脂肽类生物表面活性剂依照结构分为线性和环状两类，线性脂肤是短或者氨基酸通过酞胺键与脂肪酸相连,环状脂肤除此之外脂肪酸分子通过一个内脂键链接到亲水的肤的另一端从而形成一个环状结构。大多的脂肤具有抗菌活性，例如surfactin具有明显的抗细菌活性；fengycin有抗丝状真菌和抑制磷脂酶A2芳化酶活性的能力。迄今为止，关于脂肤抗菌活性及生理作用已有很多报道[7]。
生产脂肽类生物表面活性剂的海洋微生物有环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)及圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)[5](表2)。
表2脂肽类表面活性剂生产菌及其产物活性
生产菌名称
环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)
2
产物特性 抗菌活性、无溶血活性
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) 1.3 磷脂和脂肪酸类
抗菌活性、表面活性剂活性
乳化
有些微生物在以疏水性物质(如烷烃、PAHS)为碳源的情况下，可以产生大量的脂肪酸和磷脂类表面活性剂[7]。磷脂由亲水的磷酸基和亲油的烷基构成，可分为甘油磷脂和鞘磷脂两种。磷脂广泛分布于动物肝脏、脑和神经细胞中以及植物种子里，是细胞的必要组成成分。红球菌属(Rhodococcus)和硫杆菌属(Thiobacillus)的一些细菌在一定培养条件下可大量分泌磷脂。脂肪酸和中性脂生物表面活性剂以梭酸基为亲水基，包括甘油酯、脂肪酸、脂肪醇等。此类生物表面活性剂中较为常见的是脂肪酸单甘油酯。华兆哲等在研究南极假丝酵母(Candida AntarcrieaWSH112)时发现，CandidaAntarctieaWSHllZ在以烷烃为碳源时可产生甘油酯类生物表面活性剂，该生物表面活性剂具有较高的热稳定性，能将水的表面张力降到38mN/m[8]。
Maneerat等[9]报道了Myroides SM1菌株能生产均有表面活性的胆汁酸。此外，M.odoratus JCM7458 和M.odoramitimus JCM7460也能生产此类型的生物表面活性剂[5]。
1.4 聚合表面活性剂
醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)RAG1能产生一种有效的聚阴离子杂多糖，是水中烃类非常有效的乳化剂；Nayon-venezia等从抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)KA-53分离出了一种含丙氨酸的阴离子杂多糖蛋白生物表面活性剂；荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescence)在汽油上生长时可产生一种生物乳化剂，它由50%的碳水化合物、19.6%的蛋白质和10%的脂组成。Satpute S K[5]等综述了生产聚合生物表面活性剂的海洋微生物种类(表3)
表3脂肽类表面活性剂生产菌及其产物活性
生产菌名称
醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)RAG1
醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)A2 醋酸钙不动杆菌(A.calcoaceticus)BD4 抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)
3
产物特性 乳化 分散 乳化 表面活性剂活性
假单胞菌(Pseudomonas nautica) 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescence)
链霉菌(Streptomyces) 盐单胞菌(Halomonas)
耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)NCIM 3589 耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)IMUFRJ 50682 2 生物表面活性剂表面活性的评价 2.1 生物表面活性剂表面活性的评价方式
评价生物表面活性剂的表面活性有以下两种方式[10]: (1) 空气/水之间的表面张力和油/水之间的界面张力
乳化 与碳源有关 乳化、降低表面张力
乳化 乳化 乳化
蒸馏水的空气/水表面张力大约是72 mN/m，典型的表面活性剂(化学合成的或微生物的)会把此值降到30~40 mN/m。不同种类的生物表面活性剂降低表面张力的能力有所差异。
(2) 生物表面活性剂的效率——临界胶束浓度CMC (CriticalM icelle Concentration)
当表面活性剂达到一定浓度后,活性剂分子形成球状、层状、棒状的聚集体，它们的亲油基团彼此靠在一起,而亲水基团向外亲向水相,这样的聚集体叫做胶束。能够形成胶束的最低表面活性剂浓度叫做临界胶束浓度。CMC越低，说明表面活性越高。
2.2 生物表面活性剂表面活性定性分析
生物表面活性剂表面活性定性分析方法主要有以下三种：排油圈法、血平板法、液滴坍塌法[10]。
(1)排油圈法
排油圈法是定性分析表面活性剂活性的主要方法之一。以液体石蜡为例,取一直径12cm的培养皿,在其中加入60mL水和8mL液体石蜡。液体石蜡在水面形成油膜，在油膜中心加入1mL的发酵液，由于表面活性活性剂分子亲水、亲油基团的定向排布，中间的液体石蜡被挤向四周形成排油圈。表面活性剂的活性越强，形成的圆圈的直径也就越大，通过排油圈直径的大小来衡量微生物代谢产物的表面活性，定性地得到生物表面活性剂降低表面张力的能力。
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(2)血平板法
羊血红细胞的溶解是一种简单容易的衡量表面活性剂活性的方法。是否具有溶血圈来判断该菌种是否可以产生生物表面活性剂，溶血圈的大小代表了菌种产生表面活性剂的能力。因为产生生物表面活性剂的菌种有很强的抗菌溶菌作用，它可以将血琼脂平板上的血细胞水解，使菌落的周围产生明显的透明环。尽管如此，这种方法存在着缺陷，如果血平板制作不好不易出现溶血圈。另外，该方法不能用于衡量依赖烃类物质的微生物产生的生物表面活性剂活性，因为烃类物质能与血红细胞发生反应，影响实验结果，而且溶血性可能与微生物存在溶血酶有关，而不能确定是否是生物表面活性剂产生的效果。
(3)液滴坍塌法
该法是利用96孔板盖对生物表面活性剂的表面活性进行定性分析的一种方法。该方法的原理是当一个水滴加到疏水剂的表面时，如果水滴中含有表面活性剂，其表面张力或疏水平面和水滴之间的界面张力就会降低，这样就导致了水滴在疏水表面扩散，使液滴坍塌失去球状。样品液滴在孔中坍塌扩散的直径大小与生物表面活性剂的含量成正比，直径的大小反应出样品中表面活性物质的含量。由此，我们可以定性地研究生物表面活性剂的表、界面张力。 2.3 生物表面活性剂表面活性定量分析
这主要是指其表、界面张力的测定。表、界面张力的测定有很多方法，如毛细管上升法、滴重法、最大气泡法、Du Nouy脱环法、Wilhelm吊片法、振荡射流法、旋滴法、滴外形法。各种方法都有其特定的使用范围，如毛细管上升法只能测定表面张力，DuNouy脱环法测定表面活性剂的表面张力时误差很大。其中生物表面活性剂表、界面张力的测定最常用的方法是DuNouy脱环法也就是吊环法。吊环法是将吊环浸入溶液中，然后缓缓将吊环拉出溶液，在快要离开溶液表面时，溶液在吊环的金属环上形成一层薄膜,随着吊环被拉出液面，溶液的表面张力将阻止吊环被拉出,当液膜破裂时，吊环的拉力将达到最大值，自动界面张力仪将记录这个最大值。按照一定公式校正后，可以得出溶液的表、界面张力值
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3生物表面活性剂产生菌的筛选方法
选育生物表面活性剂产生菌的关键在于建立有效的筛选模型。Mulligan等
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