不同微生物适合生长pH值也有差别,细菌、放线菌适宜生长在微碱性的条件下,而真菌适合生长在酸性条件,在大多数酸性土壤中( pH 值低于5) ,真菌数量相对较多,因此在这些土壤中,真菌所起的作用也比较大。除了土壤碳氮元素和pH因素外,土壤中的其它营养元素,如磷、硫等也影响土壤微生物生长和群落结构。另外,土壤中一些Ca、Mg、Mn、Fe等微量金属元素,也影响土壤微生物生长。 1.3不同经营措施对微生物群落结构的影响 1.3.1外施农药、化肥等措施
农药等杀虫剂作为一种外施入土壤生态系统的物质,它和土壤中其它物质一样能被土壤中的微生物或其分泌的酶降解,从而刺激或抑制了土壤中微生物的活性,引起土壤微生物群落结构的改变。A. C. Das(2000)研究不同杀虫剂对土壤微生物影响,发现HCH部分的有机磷杀虫剂等在田间合理的剂量下使土壤中细菌迅速增加,对放线菌、真菌刺激作用则不显著。通过对微生物具体种属的研究发现,对土壤中的优势种群影响不大,而次优种可能受到抑制导致其他种群大量生长,从而引起土壤微生物多样性其及结构的变化[ 35 ] 。同时,有一些杀虫剂不能被一种微生物降解,但可以微生物之间进行的共代谢分解[ 36 ] 。另外,还有一些杀虫剂对土壤中微生物产生毒害的影响[ 37 ] 。Novka等曾报道除草剂与微生物量的负相关性,尤其在水热条件差的情况下,增加剂量和高频率使用,以及几种除草剂的混合使用,微生物生物量和呼吸强度降低,群落结构发生变化[ 38 ] 。可见农药,除草剂等化学外源物质加入土壤对土壤微生物的影响比较复杂,受农药,除草剂类型、剂量、施用方式,以及土壤类型、温度和水分等条件的影响。施肥对土壤微生物影响也很大,张 翔等(1998)通过15年定位研究发现施肥能明显增加微生物数量,长期施用化肥或配合施用有机肥和无机肥比不施肥,单施肥耕作层微生物数量增多[ 39 ] 。W. Borken (2000)研究了长期堆肥处理对森林土壤微生物呼吸、土壤微生物生物量碳、氮,土壤有机碳,土壤总氮的影响,结果发现施用堆肥初期土壤中微生物活性,数量增加,但是2年后土壤有机层微生物活性,呼吸下降,而土壤矿物层微生物活性、呼吸却升高,原因可能是由于熟化堆肥长期处理改变了堆肥养分的释放和土壤有机层的可溶性有机质量的改变,另外熟化堆肥使用量的不同对土壤微生物影响效应也有差异[ 40 ] 。施用肥料除了直接影响土壤化学成分变化,引起土壤微生物活性,土壤微生物群落结构改变外,
肥料能改变土壤的物理性状,影响地上植被的生长,从而间接的影响土壤微生物群落结构。Katarina and Erland ( 2004)研究了不同氮肥对根际微生物的影响,氮肥的增加引起根系分泌物的改变,铵态氮肥使根际微生物吸入胸腺嘧啶的量减少,根际pH值下降,植物茎长度比对照短,而硝态氮肥没有明显影响[ 41 ] 。将石灰、木灰等施入土壤中进行土壤恢复在农林生态系统管理上是一种常用的措施,并随近年来化肥施用引起环境污染, 使得这一措施更为重要。Zimmermann and Frey (2002)研究发现在酸性森林土壤中施入木灰(wood ash)以后土壤微生物活性短期急剧增加,而对土壤化学性状影响比较持久[ 42 ] 。另外,B?? th and Arnebrant (1994)研究发现WA应用对土壤微生物活性增加有长期效应[ 43 ] 。WA 应用于森林生态系统对森林土壤微生物影响,一方面增加了土壤中微生物可利用的营养元素,另一方面改变了土壤物理形状,从而引起土壤中微生物群落结构的改变。
1.3.2连栽、轮栽等措施
在农业和林业经营上有连载、轮作和间作等不同的模式,并且由于栽种不同的植物,导致土壤中微生物差别很大。这是因为不同的植被其凋落物,根系分泌物等进入土壤可以被土壤微生物利用的食物资源不同,而且地上植被能影响到土壤温度、湿度等环境因素,从而对微生物结构产生不同的影响。陈 灏等通过对种植不同农作物的农田进行16SrNA分析发现种植不同作物的农田中存在其特殊的微生物种群[ 44 ] 。在森林生态系统中不同林型条件下土壤微生物群落结构差别更大,因为在森林系统中土壤微生物主要的营养来源是植被凋落物。在人工林系统研究中发现混交林土壤中微生物多样性比纯林多样性高,纯林土壤生物多样性下降可能是近年来人工纯林土壤衰退,森林生产力下降原因之一[ 45, 46 ] 。在农业和林业生产上存在一个普遍的现象是连作障碍。所谓连作障碍就是指在同一块地上连续栽种同一种作物或树木后,其生产力下降。对于这种现象科学家对其进行了广泛的研究,很多研究发现连栽后土壤中微生物多样性降低了,土壤中出现了一些产生有害物质的微生物,从而导致连栽杉木人工林土壤质量下降[ 19 ] ;杜国坚等(1995)研究发现连栽杉木林地土壤微生物中的细菌、放线菌数量下降而真菌数量出现增加[ 47, 48 ] ;也有研究发现杉木连栽后土壤中根际微生物数量增加,非根际微生物下降的现象,这可能是连栽导致根系分泌改变的缘
故[ 49 ] 。而进行轮作或栽种混交林后能使土壤微生物群落结构改善,陆地生态系统中物质、能量循环得以顺利进行,使林地生产力得以提高[ 45, 46 ] 。 1.3.3因物种的引入等措施
近年来,随着分子生物技术的发展与应用,越来越多的转基因植物被用于农林生产中. 转基因植物引入生态系统后,会对环境产生怎样的影响成为科学家关注的问题,转基因植物对土壤中微生物群落结构产生怎样影响也引起有关学者的重视。Donegan等(1995)研究了一种能产生内毒素的转基因棉花对土壤中细菌、真菌数量和结构的影响。他们发现产生内毒素的转基因棉花使土壤中微生物数量出现短暂的增多,用BIOLOG系统和DNA指纹技术等方法发现土壤微生物结构也发生变化。但是如果只加入纯净的毒素对微生物区系多样性影响则不显著。他们认为,不是由于外源底物引起微生物群落结构发生变化,可能是由于外源基因的引入使植物体内在的化学特性发生了改变,从而使植物分解加快,促使土壤微生物数量增加,土壤微生物群落结构变化[ 50 ] 。但是,究竟怎样影响土壤中微生物的群落结构,影响程度多大还有待今后进一步的研究。另外,也有大量转基因的微生物被释放到环境中用来降解环境中的污染物质,这些转基因微生物释放到环境中的会对土壤中原有的土著微生物群落结构产生怎样影响,都应该成为我们今后研究的问题。
2土壤微生物群落结构研究方法 2.1生物标志物（Biomarker）法
使用生物标志物来定量描述土壤微生物的群落结构组成是最常用的方法之一。这种生物标志物通常是微生物细胞的生化组成成分或是细胞外分泌产物。当测定土壤中这些化合物时，首先使用一种合适的提取剂直接把其从土壤中提取出来，然后对提取物进行纯化后用合适的仪器加以定量测定。用这种方法来定量描述土壤微生物的群落结构组成的优点是既不需要把微生物的细胞从环境样中分离，同时又能克服由于对微生物培养而导致不同微生物种
群可能会发生选择性生长所造成的麻烦。磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）图
谱分析、脂肪酸（fatty acid, MFA）谱图以及甲基脂肪酸酯（fatty acid methyl ester, FAME）谱图分析在群落动态分析上的应用十分广泛。磷脂是构成生物细
胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%[3]。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。另一个重要因素是脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来[4]，然后用气相色谱分析，得出PLFA 谱图。群落的微生物结构发生变化，即可以通过谱图的变化得到快速有效的监测。甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物，该法利用MIDI 系统（一种气相色谱分析系统）分析出全细胞的FAME 谱图。Wilkinson SC[5]等人用PLFA 谱图法找出了微生物群落与树木根系的关系。Haack[6]等人通过试验验证了FAME谱图法分析土壤微生物群落的可行性，还同时进行了生物量、分类结构实验，结果表明FAME 谱图法能够监测土壤微生物群落细微变化。为人们提供了一个监测土壤微生物群落结构的常规方法。Yao Huiying[7]等应用PLFAs 分析了8 个不同肥力水平和种植历史的中国红壤的微生物群落结构，发现PLFAs 总量与土壤有机C、总N、微生物量C和基础呼吸呈显著正相关，种植历史和植被类型对土壤微生物群落结构有很大影响。FAME 分析法为种内关系的建立提供了一个快速而可靠的方法，但不同属甚至不同科的微生物的FAME 有可能重叠，因在区分关系较远的微生物应用上有一些困难。但以 FAME 的多样性来表示一
个不太复杂的生态系统的生物多样性仍有一定的参考价值。 2.2 BIOLOG 微平板研究单一碳源底物利用能（Sole-Carbon-SourceUtilization，SCSU）
该方法最初由美国的 BIOLOG 公司于1989 年开发成功，最初应用于纯种微生物鉴定，至今已经能够鉴定包括细菌、酵母菌和霉菌在内的2000 多种病原微生物和环境微生物。1991 年Garland 和Mills开始将这种方法应用于土壤微生物群落的研究[8,9]。这种方法是基于微生物群落对 95 种不同C 源的利用度来描述群落中微生物的动态变化。微平板中有氧化还原指示剂和95 种不同C 源，加入样品后，由于样品对每种C 源的利用能力不同，导致氧化剂颜色变化不同，用分析系统分析结果，就可以得到群落代谢的变化情况。这样，这种C 源利用度的信息就可以用来研究不同环境条件引起的微生物群落变化。杨元根等[10]用Biolog方法研究了英国阿伯丁市城市土壤和邻近农村土壤的微生物群落结构和
功能多样性。结果表明，在重金属元素的胁迫下，城市土壤的微生物群落与农村土壤相比发生了显著的变化。
由于不同的微生物对同一 C 源的利用能力是有差异的，微生物对不同单一C 源的代谢指纹差异并不能简单地归纳为微生物群落数量和结构的差异，而且土壤微生物在BIOLOG 系统中生长时，由于温育环境的改变引起微生物对C 底物实际利用能力的改变，使得BIOLOG 方法在准确性方面受到一定限制，但BIOLOG 方法因快速、简便而受到人们的欢迎。 2.3 土壤总DNA 复性分析
通过测定土壤 DNA 的碱基组成和复杂性可估计出总的遗传结构及其复杂性。分析DNA 的溶解曲线可以得到碱基组成的G+C 百分比。对于一个恒定的DNA 浓度来讲，复性速率是DNA 多样性的倒数。Britten 和Dohne[11]引入C0t1/2 这个术语来表示基因组的大小，C0 表示实验开始时，单链DNA 中碱基对的原始摩尔浓度，t1/2 表示半数DNA 发生复性时所需要的时间， 它是以秒为单位的（C0t1/2=K-1）。他们证实从一个种中分离所得的DNA，在没有DNA 重复序列存在时，它的C0t1/2值和这个种的基因组大小成正比。从土壤中抽提所 得到的DNA 是各种不同类型微生物DNA 的混合物，其比例也有着很大的差异。C0t1/2 值提供了DNA复杂性的资料。目前，已将C0t1/2 作为多样性的指标，它是测定群落总的遗传复杂性的方法之一，它反应了群落中信息的量以及这些量是如何分布的。Torsvik 等[12]用DNA 复性试验研究了挪威一处山毛榉树林土壤的微生物群落多样性。根据试验结果估计每克土壤中大约有4000 种微生物。土壤总 DNA 复性分析是较早应用的方法，该
方法对土壤微生物组成结构的估计是比较粗放的，准确性也差，提供的信息少，现在已很少使用。
2.4 以PCR 为基础的rRNA 及rDNA 的分析方法
rDNA 在细胞中相对稳定，拷贝数多，并存在于所有细菌中。rDNA 由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守，素有“细菌化石”之称，是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。原核生物的rRNA 分为3 种，分别为5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA，并且它们位于同一操纵子上。其中，16S rRNA 序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，23S rRNA 分子比较大，并且只有少