硬脂酸镁的微生物限度检查
一、 概述
本报告按USP31中“〈61-62〉非灭菌产品的微生物学检查”的规定，对硬脂酸美的微生物学检查方法学考察。参照企业提供标准，通过测试实验制定适合于本品的微生物学检查的方法。 企业提供标准：
总需气菌数（TAMC）不得过1000 cfu/g；霉菌及酵母菌总数（TYMC）不得过500 cfu/g；每1g样品不得检出大肠埃希菌；每10g样品不得检出沙门氏菌。
二、 方法学 1、 培养基及试剂
实验用培养基及缓冲液均符合USP规定。 BP：pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液 CA：溴化十六烷基三甲铵 MCA：麦康凯琼脂 MCB：麦康凯肉汤 MSA：甘露醇盐琼脂 RVS：RV沙门菌增菌肉汤 SDA：沙氏葡萄糖琼脂 SDB：沙氏葡萄糖肉汤 TSA：大豆胰酪胨琼脂 TSB：大豆胰酪胨肉汤 XLD：赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 2、 实验菌株
黑曲霉 ATCC16404
枯草芽孢杆菌 ATCC6633，CMCC(B)63501 白色念珠菌 ATCC10231，CMCC(F)98001 大肠埃希菌 ATCC8739 铜绿假单胞菌 ATCC9027
霍乱沙门氏菌 ATCC14028
金黄色葡萄球菌 ATCC6538，CMCC(B)26003
本实验取用中国临床医学菌种保存中心（CMCC）的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和金黄色葡萄球菌。这三株菌也来源于ATCC。实验用菌株，自种子批启用传代不超过5次。黑曲霉为3个月内制得的4℃保存的孢子悬液，可直接稀释使用。参照表格2，将其他6株菌分别接种至规定的培养条件培养。上述各菌分别以pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液10倍稀释至大约50-100 cfu/mL的浓度，备用。参照表格2各菌株的生长条件，采用浇碟法测定稀释得到的最终菌液浓度。 3、 方法学
本部分主要包括培养基特性测试和方法的适用性考察。 3.1 培养基特性测试
按照USP31中“〈61-62〉非灭菌产品的微生物学检查”的规定，与已经通过测试验证的参比培养基（MⅠ）相比，当微生物限度检查用培养基（MⅡ）符合以下标准，则用于硬脂酸美的微生物学检验：
a. 固体培养基的促生长能力：与MⅠ相比，MⅡ的回收率应在50%-200%之间。 b. 固体培养基指示能力：与MⅠ相比，规定菌株在MⅡ的生长特征应与之类似。 c. 液体培养基促生长能力：与MⅠ相比，规定菌株在MⅡ有明显浑浊。 d. 抑制能力：无论是固体培养基或是液体培养基，规定菌株在其不得生长。
对于固体培养基，通常采用平皿计数法(包括浇碟法和表面接种法)来评价培养基特性，每次平行测试两皿，最后取平均数为计算结果。培养基特性测试结果见表格3-表格5。 3.2 方法适用性
当微生物学检查方法符合以下要求时，说明该方法适用该品种：
a. 样品供试液不得抑制测试菌株的生长。计数实验中，测试微生物在供试样品中的回收率不得低于接种量的50%；控制菌检查中，测试菌在含有规定量供试品的环境中应可以生长。
b. 样品自身含有的微生物水平不得干扰菌株回收实验。
供试液制备：
以70%的乙醇擦拭供试品的外包装，使自然挥干。由于硬脂酸美是一种脂溶性物质，因此用表面活性剂吐温-80将其溶解。无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶，加入一定量的45℃灭菌的含1%吐温-80的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，振摇使分散均匀，制成1:40的供试液。 计数方法适用性：
a. 实验组：取4个直径为9cm的无菌平皿。其中两个平皿中加入1:40供试液4mL和50-100cfu 测试菌，取另两平皿加入1:40供试液2mL和50-100cfu测试菌。每个平皿倾注45℃表格2中的规定培养基，摇匀。待琼脂凝固后，参照表格2的条件倒置培养。5株测试菌（黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌）均进行该测试。
b. 样品组：取8个直径为9cm的无菌平皿。其中两个平皿中分别加入1:40供试液4mL和2mL，每个平皿倾注45℃ TSA；取另两平皿加入1:40供试液4mL和2mL，每个平皿倾注45℃ SDA；各平行测试两皿。参照表格2培养。记录平皿计数结果，计算测试菌回收率。
c. 菌液组：计数方法适用性检查中测试菌包括5株测试菌，分别为黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。参考表格2培养条件，采用浇碟法计数，确定接种量。 d. 回收率计算公式如下：
回收率? A-B?100% CA-实验组平均菌落数；B-样品组平均菌落数；C-菌液组平均菌落数。
控制菌测试方法适用性： 大肠埃希菌
a. 预培养：取1:40供试液40mL（相当于1g）至400mL灭菌TSB，混匀，置30至35℃培养18至24小时。
b. 阳性组1：接种50-100cfu大肠埃希菌至灭菌TSB中，置30至35℃培养18至24小时。
c. 实验组1：取1:40供试液40mL（相当于1g）和50-100cfu大肠埃希菌至400mL灭菌TSB，混匀，置30至35℃培养18至24小时。
d. 阳性组2：取1mL灭菌TSB和50-100cfu大肠埃希菌至100mL灭菌麦康凯肉汤中，置42至44℃培养24至48小时；划线接种至麦康凯琼脂，30至35℃培养18至72小时。
e. 实验组2：取TSB预培养物1mL和50-100cfu大肠埃希菌至100mL灭菌麦康凯肉汤中，置42至44℃培养24至48小时。划线接种至麦康凯琼脂，30至35℃培养18至72小时。 沙门氏菌
a. 预培养：无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶，加入45℃的400mL1%吐温-80的灭菌TSB，振摇使分散均匀，置30至35℃培养18至24小时。
b. 阳性组1：接种50-100cfu霍乱沙门氏菌至灭菌的1%吐温-80的TSB中，置30至35℃培养18至24小时。
c. 实验组1：无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶，加入45℃的400mL灭菌的1%吐温-80的TSB，振摇使分散均匀。加入50-100cfu霍乱沙门氏菌置30至35℃培养18至24小时。
d. 阳性组2：取0.1mL灭菌TSB（含1%吐温-80）和50-100cfu霍乱沙门氏菌至10mL灭菌RVS肉汤中，30至35℃培养18至24小时；划线接种至XLD琼脂，30至35℃培养18至48小时。
e. 实验组2：取TSB（含1%吐温-80）预培养物0.1mL和50-100cfu霍乱沙门氏菌至10mL灭菌RVS肉汤中，30至35℃培养18至24小时；划线接种至XLD琼脂，30至35℃培养18至48小时。 4、 讨论
表格3至表格5表明本品涉及到所有培养基均符合微生物学检查用的要求。培养基的灭菌方式各异，参见表格1。表格6至表格8表明硬脂酸美并不抑制各株测试菌的生长。计数实验中，胶囊壳自身的颜色使得琼脂清晰度降低，使得对3株细菌（枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌）的计数较为困难，但并不影响黑曲霉和酵母菌的计数。因此，通过方法适用性实验，确定以增加培养基体积的方式使得平皿计数可行。控制菌检查方法依照常规方法即可满足。本品微生物学检查方法的具体内容在后续细述，详见“微生物学检查检验操作程
序”。
三、 微生物学检查检验操作程序 1、 供试样品制备
以70%的乙醇擦拭供试品的外包装，使自然挥干。无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶，加入的45℃含1%吐温-80灭菌pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，振摇使分散均匀，制成1:40的供试液。取1:40供试液4mL至6mL pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，制得1:100供试液。 2、 计数测试
实验中均使用直径为9cm的灭菌平皿。
a. 需气菌计数（TAMC）：取1:40供试液2mL，平行测定4皿；取1:100供试液1mL，平行测定2皿，分别倾注15-20mL45℃ TSA琼脂，充分摇匀分散供试品。待平皿中琼脂凝固后，30-35℃倒置培养3至5天。
b. 霉菌和酵母菌计数（TYMC）：取1:40供试液2mL，平行测定4皿，；取1:100供试液1mL，平行测定2皿，倾注15-20mL45℃ SDA琼脂，充分摇匀分散供试品。待平皿中琼脂凝固后，20-25℃倒置培养5至7天。
按照规定培养条件结束培养后，点击平皿中的菌落数（CFU）。通过平皿计数结果求算均值，最后转换为相当于每g样品中含有的菌落数。若样品中未检出菌落，则结果可解释为“每g样品中菌落数少于10个。”。 3、 控制菌检查 3.1 大肠埃希菌
取1:40供试液40mL（相当于1g）至400mL TSB，混匀，置30至35℃培养18至24小时，观察结果。取TSB培养物2mL接种至100mL麦康凯肉汤，置42至44℃培养24至48小时，观察结果并划线接种至麦康凯琼脂，置30至35℃培养18至72小时，逐日观察结果。 3.2 沙门氏菌
无菌操作取10g硬脂酸美置灭菌过的三角烧瓶，加入400mL的45℃灭菌TSB（含1%吐温-80），振摇使分散均匀，置30至35℃培养18至24小时，观察结果。取0.1mL TSB培养物接种至10mLRVS肉汤，置30至35℃培养18至24小时，观