体外受精中1PN及 0PN(2PB)胚胎发育替能及影响因素分析
张亚摘, 殷宝莉, 张翠蓮·, 韦多, 郝好英, 宋小兵, 谢娟珂
(郑州大学人民医院生殖医学研究所/河商省人民医院生殖医学研究所,郑州 450003)
【摘要】
目的 初步探讨体外受精一胚胎移植周期中lPN及 OPN(2PB)胚胎形成的影响因素和发育潜能,以探寻提高卵母细胞利用率的可行性方法,
方法 对787个 IVF周期和298个 ICSI周期患者授精后l8-20 h观察到的lPN及 0PN (2PB)胚胎继续进行体外培养,观察其原核及卵裂情况,序贯培养至 D6 ,观察囊胚形成情况;并回顾性分析这些患者的临床资料,研究lPN及 OPN(2PB)胚胎形成的影响因素。
结果 (l)lPN及 OPN(2PB)胚胎可卵裂并形成囊胚,但卵裂率(分别为90.l6%和88.ll%)和囊胚形成率(l7.09%和30.03%)均显著低子2PN胚胎(分别为98.40%和45.7l%)(P均<0. 05);
(2) lPN胚胎的形成随患者的年龄、体外受精方式及获卵数的不同而不同,而 0PN(2PB)胚胎的形成只随患者年龄不同而异(P< 0.05);
(3)经 Logistic回归分析发现,lPN和 0PN(2PB)胚胎的形成与患者选择的受精方式、MII卵数、2PN胚胎数相关(P< 0.05),而与患者的年龄、体重指数、基础内分泌水平及获卵数无关(P< 0.05)。
结论 患者的体外受精方式、获得的 MII卵数以及受精后的2PN胚胎数可能影响到1PN和0PN(2PB)胚胎的形成;lPN及0PN(2PB)胚胎有一定发育潜能,但较2PN胚胎低;在行補助生殖技术助孕过程中,应综合考虑各种影响因素,以降低lPN和 0PN(2PB)胚胎的发生率,提高卵母细胞的临床利用率。
【关键词】 体外受精; 单原核(1PN)胚胎; 胚囊; 发育潜能; Logistic回归
在人类体外受精一胚胎移植(IVF-ET)技术中, 常于授精后 16~20 h 内通过光学显微镜对胚胎原核数目进行观察及评分,正常受精的判断标准为观察到胚胎内存在明确的2PN(pronucleus)及2PB (polar body)。然而,在胚胎培养过程中,常有相对较多的异常受精情况出现,其中 IPN的发生率约为2%~5%。在临床治疗过程中, 1PN及 0PN (2PB)胚胎通常被视为异常受精胚胎,与多原核胚胎及发育停滞的 2PN胚胎一起作为废弃胚胎被销毁。事实上,部分1PN及 0PN(2PB)胚胎是正常受精的胚胎,只是因为错过了最住的观察时机,被误认为是异常受精,如果将这类胚胎全部销毁,会造成胚胎资源的浪费。
本研究回顾性分析787个IVF周期和298个ICSI周期患者的1PN 及 0PN(2PB)胚胎的继
续培养情况,探讨这类“异常受精”胚胎的发育潜能,同时分析患者的l1告床资料,研究1PN 及 0PN(2PB)胚胎形成的影响因素,为降低1PN 及 0PN(2PB)胚胎的发生率,提高卵母细胞利用率提供指导。
资料与方法
一、临床资料
选择2014年7月28日至2014年10月31日就诊于河南省人民医院生殖中心的不孕症夫妇的临床资料。
纳入标准:基础内分泌水平正常;≤3个治疗周期;HBV及 HIV阴性。
排除标准:生殖泌尿系统急性感染或性传播疾病;严重的遗传、躯体疾病或精神疾患;吸毒等不良嗜好;获卵数< 1个;短时受精联合早期补救 ICSI(Re-ICSI)。
本研究共包括787个 IVF周期和298个 ICSI周期的不孕症夫妇的临床资料。
二、患者诊疗方法回顾
1. 促排卵方案及卵母细胞的采集与处理:接受IVF-ET治疗的不孕症患者采用本中心常规方案进行控制性促排卵,当 ≥ 3个卵泡直径达18 mm时,结合血清雌二醇(E2 )、孕酮(P)值,适时予以HCG(丽珠制药)5000~10 000 U肌肉注射;36 h后在阴道超声引导下,使用18 G取卵针(Cook,瑞典)来集卵冠丘复合体( OCCC),将其于加有G-MOPS缓冲液( Vitrolife,瑞典)的培养皿中洗涤两次后,转入含G-IVF-PLUS培养液(Vitrolife,瑞典)的培养皿中,置于37℃、体积分数6% C02、体积分数5% 02的饱和湿度培养箱中培养。
2. 精子处理: 精液处理来用密度梯度离心法。处理后的精子沉淀经1 m1的G-IVF-PLUS培养液Vitrolife,瑞典)上游后,取上游液分析精子浓度。
3.受精:IVF周期患者于取卵后约3 h后行体外授精,加精浓度为每卵 0 5~1万条精子;精卵共孵育约,1 h后机械剥离颗粒细胞,转入含有G,-PLUS培养液(Vitrolife,瑞典)的培养皿中。
ICSI周期患者于取卵后约3 h后将孵育后的卵母细胞经透明质酸酶(Vitrolife,瑞典)消化后机械剥离颗粒细胞,将卵母细胞置于含有G-IVF-PLUS 培养液(Vitrolife,瑞典)的培养皿中预培养1 h后, 挑选形态相对正常的精子对成熟的卵母细胞行单精子注射,注射后的卵母细胞转入含 G1-PLUS培养液(Vitrolife,瑞典)的培养皿中培养。
4.胚胎观察及评分:授精后18~20 h于倒置显微镜下观察受精情况,记录原核数目, 原核和胚胎形态学的观察参照之前的研究。若观察时胚胎出现两个原核及两个极体,则为2PN胚胎;若只有一个原核,则为1PN 胚胎;若观察不到原核但有两个极体,则为 0PN( 2PB)胚胎。
2PN胚胎于 D2和 D3在倒置显微镜下评估卵裂期胚胎的形态,包括胚胎细胞数、碎片比例、细胞大小是否均匀等情况,参照文献标准。可利用胚胎为细胞数多于4个且评分高于2分的胚胎,可继续培养至囊胚;根据患者的具体情况决定其2PN胚胎的去向:移植、冷冻或是囊胚培养。进行囊胚培养的2PN胚胎,于 D5和 D6对囊胚进行评估,囊胚分级的方法为 Gardner囊胚分级法。我中心可利用囊胚标准为:3BB及以上的囊胚;优质囊胚标准为:评分为4AA、4AB、4BA和 IBB的囊胚;可利用囊胚及优质囊胚可进行移植或冷冻保存,冷冻的囊胚择期复融后进行移植。
临床上常规将1PN胚胎及 0PN( 2PB)胚胎丢弃。本研究中所有的1PN及 0PN(2PB)胚胎均进行序贯培养,培养至 D6 ,胚胎及囊胚的评分标准同上。
上述整个过程均取得患者的知情同意且获得医院伦理委员会的批准。
三、观察指标
2PN胚胎形成率= (2PN胚胎数/获卵数)X 100%;2PN胚胎卵裂率= (发生卵裂的2PN 胚胎数/2PN胚胎数) x100% ; 2PN 囊胚形成率= (2PN胚胎形成的囊胚数/进行囊胚培养的2PN胚胎数)X 100%。
相应的1PN 及 0PN(2PB)胚胎的形成率、卵裂率、囊胚形成率来用类似计算方式。
四、统计学处理
所有数据来用 SPSS17.0软件进行统计学处理, 数据结果以均数土标准差(？土s)或率(%)表示,组间两两比较采用 LSD-t检验,率的比较来用x2检验;P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
一、患者基本情况分析
787例行 IVF治疗的患者,年龄为(31.94土5 63)岁,患者的体重指数(BMI)为(23. 26土3. 65)kg/m2;298例行 ICSI治疗的患者,年龄为(32.11土6.86)岁,患者的 BMI为(23.02土7.52)kg/m2。两组患者的基本资料和基础内分泌水平均无统计学差异(P>0.05)(表1)。
IVF治疗周期共415个周期进行了移植,共移植了760个2PN胚胎,临床妊娠241例;ICSI治疗周期有164个周期移植了264个2PN胚胎,临床妊娠102例。
二、1PN及0PN(2PB)胚胎形成及继续囊胚培养结局
370个 IVF周期的患者出现了1PN和 0PN(2PB)胚胎,形成1PN胚胎305枚,卵裂275枚,形成囊胚47枚; 0PN(2PB)胚胎412枚,卵裂363枚, 形成囊胚109枚,了1PN和 0PN(2PB)胚胎
的卵裂率及囊胚形成率均显著低于2PN胚胎(P<0.05) (表2)。
61个 ICSI周期的患者形成了1PN和0PN (2PB)胚胎,其中1PN胚胎71枚,卵裂66枚,形成囊胚5枚;2PB胚胎25枚,卵裂21枚,形成囊胚3枚.
三、女方年龄与1PN及0PN(2PB)胚胎形成的关系
女方年龄范围为20~49岁,中位数为31岁,以30岁、35岁为界值对患者进行分组。与>35岁组患者比较, 30~ 35岁组患者的2PN胚胎卵裂率、0PN(2PB)胚胎形成率及其卵裂率较高,且差异有统计学意义(P<0.05),而<30岁组患者的0PN (2PB)胚胎卵裂率较高,差异有统计学意义(P< 0.05)(表3)。
四、体外受精方式与1PN及 OPN(2PB)胚胎形成的关系
体外受精一胚胎移植周期中,常规 IVF周期的平均获卵数、1PN及 0PN(2PB)胚胎的发生率均高于 ICSI周期(P<0.05) ;而两组之间的1PN及 0PN (2PB)胚胎的卵裂率及囊胚形成率并无显著性差异(P>0.05)(表4)。
五、获卵数与1P1、1 及 0P1、1(2PB)胚胎形成的关系
获卵数的中位数为9枚(1~48枚),以5、10、15、20为界值,对患者进行分组。各组的1PN胚胎形成率及卵裂率以及 0PN (2PB)胚胎的形成率均无统计学差异(P>0.05),但各组之间2PN胚胎的形成率及卵裂率、0PN(2PB)卵裂率及2PN优质胚胎率存在显著性差异(P<0.05)(表5)。
六、Logstic回归分析结果
以是否有1PN胚胎形成为因变量,纳入患者年龄、体重指数、基础内分泌(FSH、 LH、 E2、PRL、P、T)水平、受精方式、获卵数、MII数、正常受精数为自变量,进行 Logistic回归分析,
以α= 0. 05为检验水准,P<0. 05认为差异有统计学意义。
分析发现，1PN胚胎的形成与患者选择的受精方式、MII卵数、2PN数显著相关(P<0.05) , 而与患者的年龄、体重指数、基础内分泌(FSH、LH、 E2、 PRL、 P、 T)水平、获卵数等无关(P> 0.05), 与 IVF周期相比,ICSI周期中更可能出现1PN胚胎(P<0. 05) ;当患者的 MII卵数越多,2PN胚胎数越少时,越易形成1PN胚胎(P< 0.05)。
同样,以是否有0PN(2PB)胚胎形成为因变量,进行 Logistic回归分析,发现 0PN(2PB)胚胎的形成与患者选择的受精方式、MII卵数、2PN数有关(P<0. 05) ,而与患者的年龄、体重指数、基础内分泌(FSH、LH、E2、PRL、P、T)水平、获卵数等无关(P>0. 05)。 与 ICSI周期相比,IVF周期中更可能出现 0PN(2PB)胚胎(P<0. 05) ;当患者的 MII卵数越多, 2PN胚胎数越少时,越易形成 OPN(2PB)胚胎(P<0. 05)。
讨 论