中北大学2012年发酵工程课程设计说明书
（2）进行高密度培养,首先增加生物量,以期提高单位发酵效率;
（3）由于目前关于维生素B12的代谢途径和基因表达序列已基本研究清楚，因此,可采用基因工程手段,使该基因片段能在宿主细胞中多次表达,并使其能稳定遗传,将会是维生素B12发酵的一大革命;
（4）研制新型的诱导剂,以进一步提高其产量; （5）研制高效专用的生物反应器,采用连续流加培养; （6）采用固定化技术,将菌种包埋或吸附于载
2 菌种选育
2．1 菌种的来源
维生素Ｂ12主要由链霉菌（streptomyces)产生，该菌是最大的一群放线菌,属放线菌目,链霉菌属。多数为腐生菌,好氧,革兰氏染色阳性。有发育良好的分枝菌丝，菌丝无横隔，分化为营养菌丝、气生菌丝、65孢子丝。孢子丝再形成分生孢子。孢子丝和孢子的形态、颜色因种而异，是分种的主要识别性状之一。已报道的有千余种，主要分布于土壤中。已知放线菌所产抗生素的90%由本属产生。本次设计选择链霉菌属中的灰色链霉菌来作为菌种。灰色链霉菌的孢子柄直而短，不呈螺旋形。孢子量很多，呈椭圆球形。气生菌丝和孢子都呈白色。单菌落生长丰满，呈梅花形或馒头形，直径约为3～4mm。基内菌丝透明，在斜面背
后产生淡棕色色素。 2.1.1 菌种选择性分离
菌种选择性分离的步骤一般是：
含微生物材料选择——材料的预处理——菌种的分离——菌种的培养——菌种的选择和纯化。 1 含微生物材料的选择
第6页
中北大学2012年发酵工程课程设计说明书
土壤中的微生物比较多，一般耕作土、菜园土和近郊土壤中有机质含量丰富，营养充足，且土壤成团粒结构，通气保水性好，因而微生物生长旺盛，数量较多尤其适合放线菌的生长（链霉菌也主要分布于土壤中）。 2 材料的预处理
对于从土壤中分离出链霉菌属可以在养料中加入质量分数为1%的几丁质培养，也可以用CaCO3提高pH进行培养。 3 所需菌种的分离
所需菌种的分离效率取决于分离培养基的成分，pH和加入的选择性抑制剂等。要分离链霉菌则用几丁质培养基。分离培养基的pH通常在6.7～7.5之间，在分离培养基中加入制霉菌素（50）亚胺环己酮（50）来增加选择性。 4 菌种的培养
链霉菌最适生长温度为300C，为嗜温菌，一般培养7～14天 5 菌落的选择
本次设计采用铺菌法即：于分离平板上铺一层单一的试验菌的办法可用来测定各个菌落的维生素Ｂ12生产能力。
2．2 菌种选育
育种技术可分为自然分离、经典诱变育种技术和现代生物技术。在自然界中，由于菌种基因自然突变的机率很小，而且突变往往导致菌种退化，符合生产要求的突变非常难求，因此自然选育是比较缓慢和被动的过程。同时在自然分离过程中由于菌种的同源基因反复传代，易引起菌种遗传上的退化。因此自然分离技术目前在工业生产中仅用于维持菌种的优良性状，达到纯化菌种、稳定生产的目的，很少单独用于菌种选育。在此采用诱变育种技术。 2.2.1 诱变育种的基本原理
诱变育种的理论基础是基因突变。基因突变指的是DNA分子结构中的某一部位发生变化（又称点突变）。根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变。所谓自然突变是指在自然条件下出现的基因突变，而诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。经诱变处理后，微生物的遗传物质，DNA和RNA
第7页
中北大学2012年发酵工程课程设计说明书
的化学结构发生改变，从而引起微生物的遗传变异。由于引进了有诱变剂的处理，故诱变育种使菌种发生突变的频率和变异的幅度得到了提高，从而使筛选获得优良特性的变异菌株的几率得到了提高[6]。 2.2.2 诱变育种的一般步骤 1.出发菌种的选择
链霉菌属的灰色链霉菌，该菌株是生产抗生素的主要菌株，也产维生素B12，来源广，对诱导剂的敏感程度大，变异的幅度广，产维生素B12的发酵水平较高。 2.单细胞悬液的制备
在诱变有种中，采用生理状态一致的单孢子进行诱变，这样不仅可以使细胞或孢子均匀接触诱变剂，还可以避免分离现象的发生。 3 诱变处理
仅仅采用诱变剂的理化指标控制诱变剂的用量常会造成误差，所以在诱变处理前，一定要先做诱变剂量对菌体死亡数量致死曲线，选择合适的处理剂量，选择合适的剂量要多次试验才能确定。加入10ml无菌水于新鲜斜面培养物，用接种铲将菌丝刮下，用玻璃珠打碎成菌丝碎片，经一层滤纸过滤，制成菌丝悬浮液。吸取5ml上述菌丝悬浮液于无菌培养皿中，置于波长为253.7nm、功率30W的紫外灯直下30cm处开盖、震荡照射60s。 4 突变菌株的筛选
诱变处理后，正突变的菌株很少，所以要进行大量的筛选才能得到高产菌株，根据维生素B12生物合成途径和代谢调节理论，对维生素的B12产生菌灰色链霉菌进行了推理选育，经多次紫外诱变才得到维生素B12 的高产菌株，通过初筛和复筛，并确定最佳的发酵条件，才能使链霉菌的生产能力充分发挥出来
第8页
中北大学2012年发酵工程课程设计说明书
2．3 菌种的保藏
菌种保藏是进行微生物研究和微生物育种工作的重要组成部分，其首要任务是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面发展。
目前经常采用的菌种保存方法是低温冷冻保藏如液氮保藏法和冷冻干燥法。这两种方法的保藏效果的好坏取决于使用适当的孢子培养基、斜面的培养温度和培养时间、孢子的浓度及添加适当的保护试剂。但这两种方法需要有真空干燥和冷藏设备，另外还需要保护剂，在工业化生产中较少使用，一般仅用于菌种的长期保藏。国内在生产实践中，一般使用沙土管保藏法和低温冻结保藏法。前者效果较好，操作简便，保存期在一年以上；后者的优点是存活率高，变异率低，使用方便。综合考虑本次设计选用甘油菌丝冷冻保藏法，可使菌种保存1～2年左右还保存能产维生素Ｂ12的能力。
具体做法：将冻干管中的孢子周无菌水洗出后接种到斜面培养基上培养。待孢子生长成熟后进行如下操作步骤：
(a)在斜面上加入9 mL无菌水，用棉签轻轻洗下孢子，使孢子悬浮于无菌水中；
(b)将洗下的孢子悬液倒入装有1 0颗直径为2—3 mm玻璃珠的三角瓶中，放在摇床上220 rpm，振荡l h左右；
(c)脱脂棉过滤孢子悬液，除去菌丝片段和固体培养基碎片； (d)3000 rpm离心1 5 min以使孢子沉淀，马上倒掉上清液； (e)将离心管在振荡器上振荡几秒钟使孢子沉淀物分散于残存的无 菌水中；
(f)加入无菌的40％甘油和5％乳糖，-200C冷冻保藏。
第9页
中北大学2012年发酵工程课程设计说明书
使用前需洗涤两次，充分去除甘油对孢子活力的影响。
3 培养基的配置
3.1 培养基配置的原则
培养基是指可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料，同时也为微生物生长提供除营养外的其他生长所需的条件。原则上①满足必须的原料；②生化反应的基本条件（温度、溶氧和pH）；③来源丰富、价格低廉、取材方便、质量稳定；④培养基成分不影响下游产品的提取加工。
3.2 培养基类型
培养基可以按照用途可以分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。 (1)孢子培养基
孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长迅速,产生数量多而且优质的孢子,并且不会引起菌体变异。 (2)种子培养基
种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长的粗壮，成为活力强的“种子”。 (3)发酵培养基
发酵培养基既要有利于生长繁殖，防止菌体过早衰老，又要有利于产物的大量合成。要求培养基的组成应丰富、完全，碳、氮源要注意速效和迟效的互相搭配，少用速效营养，多加迟效营养，还要考虑适当的碳氮比，加缓冲剂稳定pH值；并且还要有菌体生长所需的生长因子和产物合成所需的元素、前体和促进剂等。
3.3 链霉菌的培养基及培养条件
第10页