实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理
一 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2cm），然后再进行电泳分离。
圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。
仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。
图A
在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明：
1. 样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。 分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。样品在其中进行电泳和分子筛分离。
蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。进入小孔凝胶时遇到的阻力大， 速度就减慢了。由于凝胶的不连续性，在大孔胶与小孔胶的界面处就会使样品浓缩， 区带变窄。（2）缓冲离子成分的不连续性。(3)电位梯度的不连续性。(4)pH的不连续 性：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续性，浓缩胶应有的pH应为8.3，分离胶应 有的pH为8.9。
2. 分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓的分子筛效应。即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相等的蛋白质，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。
此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面。而在柱层析方法中的分子筛效应，则是大分子通过凝胶颗粒之间的缝隙先流出来，而小分子则通过凝胶颗粒内的孔道后流出。
3. 电荷效应：蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载有的电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的，泳动的快，反之则慢。因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个个的圆盘状。在进入分离胶时，此种电荷效应仍起作用。 二 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理
1. 性能：聚丙烯酰胺的机械强度好，有弹性，透明，相对地比较稳定，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。原料成分要采用高纯度制品，通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好，由于纯度高及不溶性，因此还适合于少量样品的制备，不致污染样品。 2. 制备原理：聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（acrylamide 简称Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（N,N,N,’N’-methylene bisacrylamide简称Bis）在催化剂的作用下聚合而成。 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：
（1）化学聚合：化学聚合的催化剂多采用过硫酸铵（ammonium persulfate简称AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为N,N,N’,N’- -四甲基乙二胺（N,N,N,’N’-tetramethyl ethylenediamine,简称TEMED），其次为三乙醇胺及二甲氨基丙腈（3-dimethylaminopropionitrile,简称DMPN）。在叔胺的作用下，由过硫酸铵形成的氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时常会延迟聚合作用。分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用，一些金属也能抑制聚合作用。冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
当聚合反应开始时，过硫酸铵溶于水产生自由基S2O82-→2SO42-，这些自由基活化TEMED使之形成带不成对电子的活化分子。活化的TEMED与丙烯酰胺分子或甲叉双丙烯酰胺分子结合时能转移自由基使之活化。活化的丙烯酰胺可再以同样方式转移自由基活化另一分子的丙烯酰胺，并与之结合，这样不断活化下去，直至使所有的丙烯酰胺活化结合成长链，其末端的丙烯酰胺分子始终具有转移自由基的活性。但仅丙烯酰胺的多聚体只能形成长链，尽管粘稠，但不能形成凝胶。（2）光聚合：光聚合通常用核黄素为催化剂。不一定加TEMED即能聚合，但加入则可加速聚合。
甲叉双丙烯酰胺是由两个丙烯酰胺分子靠甲叉基相互连接构成的，其中的两个丙烯酰胺都可以分别被活化的TEMED所活化，而后再不断活化丙烯酰胺分子结合成长链；或者分别被已形成长链的丙烯酰胺链活化连接；或者一边被TEMED活化后与丙烯酰胺形成长链，另一边与已合成的丙烯酰胺长链结合等，其反应是随机的，多种多样的，但无论如何反应，在形成的丙烯酰胺链之间由于甲叉双丙烯酰胺的横链而被连接起来，最终形成立体的网状结构。可见甲叉双丙烯酰胺是一种引入横链的交联剂。这样按一定比例的Acr和Bis在AP和TEMED的催化下形成一种具有多孔、多分枝而又相互连接的聚丙烯酰胺凝胶。
（2）光聚合：光聚合通常用核黄素为催化剂。不一定加TEMED即能聚合，但加入 则可加速聚合，用核黄素进行光聚合的优点是：①核黄素的用量很低(1mg/ml);②通 过光照可以预定聚合时间，但光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小， 不太稳定，所以用它制备大孔凝胶较适合。化学聚合的凝胶孔径较小，因而采用过 硫酸铵-TEMED催化系统制备小孔凝胶（分离胶），而且各次制备的重复性较好。
３.凝胶浓度和交联度与孔径的大小关系：凝胶浓度与被分离物的分子量大小关系，大 致如下表所示：
Mr范围与凝胶浓度的关系
蛋 白 质 核 酸 （RNA） 聚丙烯酰胺凝胶的网孔大小、机械强度、弹性均由胶的总浓度与Bis的浓度比及聚合的条件来决定。孔径与总浓度有关，总浓度越大，孔径则相应变小，机械强度增强；总浓度越小，则相反。当总浓度不变时，甲叉双丙烯酰胺（Bis）的浓度在5%时孔径最小，高于或低于此值时，聚合孔径相对变大。因此，配胶时可以通过改变丙烯酰胺的总量和甲叉双丙烯酰胺的含量，作为控制凝胶孔径大小的方法。
聚丙烯酰胺凝胶形成的网孔在电泳过程中具有分子筛的作用。因此在制备凝胶时，应该根据被分离物质的分子大小来选择凝胶的浓度。
常用的所谓标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能得到满意的结果。当分析一个未知样品时，常常先用7.5%的标准凝胶或用4%~10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。
用于研究大分子核酸的凝胶多为大孔径凝胶，太软，不易操作，最好加入0.5%琼脂糖。有的在3%凝胶中加入20%的蔗糖，也可增加机械强度而不影响孔径大小。 三 常见的几种蛋白质染色染料
1. 氨基黑10B(amino black 10B)：C22H13O12N6S3Na3 Mr=715,λmax=620nm~630nm.氨基黑是酸性染料是最常用的蛋白质染料。但用氨基黑10B染SDS-蛋白质时效果不好。氨基黑染不同蛋白质时的着色度不同、色调不一（有蓝、黑、棕等）。
2. 考马斯亮蓝Ｒ250(Comassie brilliant blue R250)：染色灵敏度比氨基 黑高5倍。尤 其适用于SDS微量蛋白质染色。
考马斯亮蓝G250，又名Xylene brilliant cyaninG。染色灵敏度不如 R250，但比氨基 黑高 3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白质而几乎无 本底色，所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于做定量分析。
聚丙烯酰胺凝胶电泳具有使样品区带浓缩变窄的作用，所以分辨率高，在很多情况下超过高速离心和常用的层析及一般电泳技术：设备简单，样品量小（1~100μg）；时间短，操作简便，可分离物质的分子大小范围广泛，由多肽到核糖核蛋白体及病毒都可以分离，亦可改变为超微量测定（10-12~10-9g），并可结合SDS来测定蛋白质亚基分子量；或测定核酸等的分子量。这种方法现在几乎取代了超速离心沉降法。它还可以结合等电聚焦电泳以提高分辨率。
聚丙烯酰胺凝胶电泳用途较广，对生物高分子化合物能进行分离定性定量分析，又能用于制备mg水平的材料。 操作方法
垂直板凝胶电泳
目前常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳是垂直板型电泳，垂直板电泳是在两块垂直放置的、间隔几个mm的平行玻璃板中进行制胶的，所得的是垂直的平板状凝胶。具有以下特点：
1. 表面积大，易于冷却控制温度。 2. 电泳后易于取出凝胶。
Mr范围 ＜104 1~4×104 4×104~1×105 1~5×105 ＞5×105 ＜104 104~105 105~2×106 适用的凝胶浓度 20~30% 15~20% 10~15% 5~10% 2~5% 15~20% 5~10% 2~2.6% 3. 能在同一凝胶板上，同一操作条件下，同时比较多个样品。 4. 可做双向电泳。
5. 便于利用各种鉴定方法，尤其便于进行放射自显影。 一 垂直型制胶模具
一般的垂直板型制胶模具是由两块长短不等的玻璃块组成（或由两块等长的玻璃片，其中一块的顶端制成“U”形）。玻璃板的长边缘之间放置两条用特殊塑料制成的间隔条（根据所需胶的厚度，选用间隔条的厚度），以配套的制胶底座和夹子固定，确保无泄漏的孔隙，即可灌胶。如无配套的制胶底座，则在两块玻璃板之间夹好隔条后，于板的两侧及底部用医用胶带或粘胶纸带封好，将1%的琼脂糖溶解，冷至50℃左右，沿模具的两边条内侧用滴管滴入，封住缝隙，以免灌胶时胶液泄漏。在较长的制胶模具中灌注胶液时，可将模具倾斜，与桌面成45~60°角，将胶液注入两块玻璃板之间的空隙中，不断轻敲玻璃板，使气泡上浮排出，一直灌到模具的顶部，此时可将模具放置成10°角，以降低泄漏的可能性，立即插入样品孔模板（或称梳子），注意梳齿的边缘不能带入气泡。室温时聚合需要40分钟左右，观察梳齿附近凝胶中呈现光线折射的波纹时，即表示聚合反应已完成。使用凝胶前，先撕去凝胶底部的胶条，将凝胶及模具安装在电极槽中，然后拔出梳子，立即用水冲洗孔格（此步很重要！因为取出梳子后，梳子上面吸附的和胶顶部少量未聚合完的丙烯酰胺会流入孔内，在慢慢聚合，使孔底不平，将影响电泳条带的形状不整齐）。垂直板型电泳装置和制胶模具见图B 二 贮液
1.贮液配方（Laemmli）(用量可依需要倍放) 贮液 配方 电极缓冲液（用时10Tris 7.55g,Gly 36g, 用水定容到250ml 倍稀释） 凝胶贮液（N） Acr 8.76g, Bis 0.24g,用水定容到30ml 分离胶缓冲液（L） Tris27.2g,,H2O120ml,用浓HCl调到pH8.8，用水定容到150ml 浓缩胶缓冲液（M） Tris9.08g,,H2O140ml,用浓HCl调到Ph6.8，用水定容到150ml 3. 不同浓度（%）分离胶的配制（可按总体积按比例放大） 贮液 凝胶浓度 5% 7.5% 10.0% 12.5% 15.0% L(ml) 6.3 6.3 6.3 6.3. 6.3 N(ml) 4.3 6.2 8.4 10.5 12.6 H2O(ml) 14.6 12.5 10.4 8.3 6.2 10 10 10 10 TEMED(μl) 10 Ap(mg) 20 20 20 20 20 4. 浓缩胶配方 M N H2O TEMED Ap 1.9ml 1.15ml 4.5ml 10mg 5μl 三 凝胶系统和制胶
垂直板型电泳的凝胶系统有两类。一类是不连续系统，主要用于蛋白质的分离；另一类是连续系统，只有一层凝胶，一种pH和一种缓冲系统，将样品透析或稀释，使样品的电导很低，这样人工造成电位梯度差异，也可使样品浓缩，达到同样分辨力。近年来在蛋白质和核酸的凝胶电泳研究中，广泛使用着这种连续系统。
1.分离胶的制备：将贮液由冰箱中取出，达到室温后，按表中的比例配制工作溶液， 分离胶先不要和过硫酸铵混合，分别放在真空干燥器中抽出溶解的空气，取出赶快 混匀，灌入玻璃板之间的空隙，达到合适的高度后，用细滴管在已经加好的分离胶
上面加3~5mm高的水层。加蒸馏水的目的，除隔离空气中的氧外，并能消除分离胶
图B
表面的曲度，使凝胶表面平坦，否则会影响带形和分辨率。因此着一步操作要特别 小心，尽量防止水与胶液的混合。注意不要打搅凝胶液面，切忌加水时成滴状坠入 胶液，这样会使顶部凝胶浓度变稀，以致改变预期的凝胶孔径，或从而造成凝胶表 面的不平坦。即使小心地操作，凝胶顶端约1~3mm有时也受影响，往往凝聚不良或 孔径改变，使这一区域内所形成的区带的迁移率值不可靠。
水层放好后，静置胶液进行聚合反应，聚合时温度要与电泳时的温度相同，正常情况下10分钟即开始聚合，应控制在30~60分钟聚合完成。
刚加水时看出有界面，随后逐渐消失，等到再看到界面时，表明凝胶已经聚合。 再静置30min使聚合完全。
2.浓缩胶的制备：当分离胶完全聚合后，甩去分离胶表面的水层，用滤纸条（无毛边）吸去残留的水液，滤纸尽量不要接触凝胶表面。按比例混匀浓缩胶（最好预先抽气，使用是混合，先用这种凝胶液漂洗一下分离胶顶，除去漂洗液后，将浓缩胶液加入玻璃板之间剩余的间隙，并立即插入样品孔模板（或称梳子），注意观察凝胶的聚合过程，观察梳齿附近凝胶中呈现光线折射的波纹时，即表明聚合反应已经完成。 3.上样
样品的用量与凝胶板厚度有关系。对2mm厚、10mm宽的样品槽，用约20μl样品 液；对4mm厚、10mm宽的样品槽，用约40μl样品液。每μl样品液约含0.1~10μg样品。形成的样品液层约1mm高。
在样品液中常加入上样缓冲液（40%蔗糖+溴酚蓝）。一般情况下，上样缓冲液与样品的比例为1：1~1：2为最宜。 电泳过程同垂直管形盘状电泳。 4.电泳
将电泳槽和电泳仪连接,上槽为负极,下槽为正极。在电泳过程中，一般要求电流保持稳定，这时可见电压升高。电泳时间与所用缓冲液和样品有关，一般可根据指示染料的迁移来决定，如指示剂染料已迁移到距分离胶的下端1cm时，就可停止电泳，关闭电源，取出凝胶装置。 缓冲液可再行使用，但应注.上下槽缓冲液不能混合或互换，因下槽混入了催化剂及