7.5.3 柱色谱
柱色谱（Column Chromatography）是最常见的色谱分离形式，茨维特的色谱实验是一个典型例子。它具有高效、简便和分离容量较大等特点，常用于复杂样品分离和精制化合物的纯化。
柱色谱主要有吸附色谱和分配色谱两类。前者常用氧化铝或硅胶为柱填料。后者以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收一定量的特殊液体作为固定相。
7.5.3.1 吸附柱色谱法分离原理
吸附柱色谱法是利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间的吸附和溶解（解吸）能力的差异而达到分离的。当组分分子到达吸附剂表面时，由于吸附剂表面和组分分子的相互作用，使组分分子吸附在吸附剂表面。当洗脱剂连续通过吸附剂表面时，由于洗脱剂对组分分子的作用力，组分分子会被洗脱剂溶解下来，在一定的温度下，吸附和溶解达到平衡。但由于洗脱剂不断地移动，这种吸附和溶解过程会反复发生并建立新的平衡，组分分子就随洗脱剂移动，移动速度与组分分子的平衡常数和洗脱剂的流速有关。当流速一定时，各组分就依据吸附平衡常数的不同而得到分离。
7.5.3.2 吸附色谱柱填料
在吸附色谱色谱中，为了使试样中各种在吸附能力稍有差异的组分能够分开，必须选择适当的固定相（吸附剂）和流动相（洗脱剂）。吸附剂的选择主要根据吸附剂性质和分析要求通过实验来现在。
对吸附剂的一般要求：（点击）
具有较大的表面积和足够的吸附能力 对不同组分有不同的吸附能力
化学惰性，即不溶于流动相，不与样品组分和流动相起化学反应 颗粒均匀，具有一定的机械强度的粒度 一般采用白色或无色吸附剂，便于观察实验
常用的吸附剂硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、纤维素等。
（1） 硅胶
色谱硅胶是由弹性多聚硅酸脱水制成，其吸附中心是硅醇基。硅酸性能稳定，是带有微弱酸性的极性吸附剂，特别是它具有很好的惰性、吸附容量大、容易制成各种不同尺寸的颗粒。硅胶可用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、萜类和甾体等。
（2） 氧化铝
色谱氧化铝由氢氧化铝在300~400℃时脱水制得，它吸附能力比硅胶强。氧化铝通常中性、酸性和碱性三种。在实际使用中，酸性氧化铝（pH4~5）主要用于有机酸、某些酯类、酸性多肽类、酸性色素等化合物的分离。碱性氧化铝（pH9.5~10.5）主要用于碱性化合物的分离。中性氧化铝用于生物碱类、挥发油、萜类、油脂、树脂、皂甙类以及酸性、碱性氧化铝可分离的化合物。
硅胶和氧化铝的吸附活性（点击）
硅胶和氧化铝的吸附能力与其含水量有关。通过加热方式除去吸附水，可提高吸附剂的吸附活性。一般通过实验测定，将硅胶和氧化铝的活性分为五级（Ⅰ~Ⅴ）。Ⅰ级硅胶的含水量最少，它的活性最高，对极性化合物的吸附能力最强。
吸附剂活度与含水量的关系
氧化铝 硅胶 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
0 3 6 10 15 0 5 15 25 38
聚酰胺 (点击)
色谱用聚酰胺是白色多孔性的非晶形粉末，它不溶于水及甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、苯等有机溶剂；对碱比较稳定，对酸的稳定性较差。聚酰胺分子内存在很多的酰胺键，它与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键，可对这些化合物进行吸附分离。
（5） 吸附剂的选择
在分离极性较强的化合物时，一般选用活性较小的吸附剂。而分离极性较弱的化合物时，就选用活性较大的吸附剂。极性吸附剂选择性地吸附不饱和的、芳香族的和极性分子。非极性吸附剂如活性炭、硅藻土对极性分子无吸附能力。
7.5.3.3 吸附色谱洗脱剂
流动相的洗脱作用实质上是洗脱剂分子与样品组分竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。为了要使试样中吸附能力稍有差异的各种组分分离，应根据试样的性质，吸附剂的活性，选择适当极性的洗脱剂。
化合物极性与其结构有关。按结构的特征，各种有机物的极性大小顺序为：
烷烃 <烯烃 <醚类 <硝基化合物 <酯类 <酮类 <醛类 <胺类 <醇类 <酚类 <酸类
常用溶剂的极性大小顺序为：
石油醚 < 环己烷 < 四氯化碳 < 苯 < 乙醚 < 乙酸乙酯 < 丙酮 < 乙醇 < 水
在进行吸附柱色谱分离时，应根据样品的性质、吸附剂的性能、流动相的极性三方面的影响因素加于选择。一般的选择规律是：样品极性较大，在极性吸附剂柱上进行分离，则应选用吸附性较弱（即活性较低）的吸附剂，用极性较大的溶剂进行洗脱。组分的极性较弱，就应选用吸附性较强（即活性较高）的吸附剂，用极性较小的溶剂进行洗脱。
样品、吸附剂和洗脱剂的极性关系
7.5.3.4分配柱色谱分离原理
分配色谱是利用各组分在两种互不混溶溶剂间的溶解度差异来达到分离的。在分配柱色谱分离时，这两种互不混溶的溶剂之一是流动相；另一种是吸收在载体或担体中的溶剂，例如，含有一定量水分的硅胶，其所含的水分可作为固定相。当流动相带着试样中的各种组分通过色谱柱时，样品组分就在流动相和固定相之间进行多次反复分配，当不同的组分分配系数有差异时，它们以不同的迁移速度通过色谱柱得以分离。
7.5.3.5 分配柱色谱的固定相和流动相
常用的载体有硅藻土型、硅胶型、纤维素和高分子聚合物型等；使用的固定相多是一些极性较强的溶剂，如水及各种水溶液，甲醇、甲酰胺等。
常用的流动相溶剂有：石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷烃和苯等以及它们的混合物。在实际工作中，为了防止色谱过程中流动相把吸附于载体上的少量水分带走，流动相应预先以水饱和，并应加入醋酸、氨水等弱酸、弱碱，以防止某些被分离组分离解。
7.5.3.6 反相分配柱色谱
用有机相作固定相，水相为流动相的色谱分离法称为反相色谱法。由于反相色谱法的固定相极性小，流动相的极性大，一些非极性的有机物在柱中移动慢，有利于分离。
对于无机物分离用的反相萃取色谱法，实际上是一种反相分配色谱法，它具有萃取方法的简便性，又有色谱分离的高效性。实验时，通常是将有机萃取剂溶于挥发性溶剂中配成适当浓度的溶液，把载体浸渍在此溶液中，搅拌或振荡一端时间后，让溶剂挥发制成固定相。
该法的特点是：
● 可节省大量的有机溶剂；
● 易改变流动相的实验条件（pH、络合剂等），提高分离选择性。
7.5.3.7柱色谱实验技术
分配柱色谱法分离速度较慢，处理量小，温度的影响较大，因此能用吸附柱色谱分离的试样总是尽量采用吸附柱色谱法来解决。
柱色谱实验技术包括柱子的准备、固定相和流动相的选择、加样和洗脱、组分收集和鉴定等步骤。每一步操作都会给分离带来影响，因此，要使混合物得到良好分离，必须根据实验原理仔细进行操作。
1）装柱
根据样品量和分析要求选择分离柱。常用直径和长度比为1:10 ~ 1:50玻璃管，下端用玻璃丝塞住或固定一砂芯板。样品量和吸附剂之比，通常为1:50 ~ 1:30。吸附剂的粒度一般为80 ~ 100目。使用前应根据需要进行活化处理。
装柱方式（点击）
● 干法装柱：将干燥吸附剂直接装柱，适用于粗颗粒吸附剂的装填。 ● 湿法装柱：将吸附剂倒入合适的溶剂中做成匀浆装柱，适合于细颗粒吸附剂的装填。
2） 加样
溶解样品的溶剂极性要小，样品浓度要适当，但加样体积要尽量小，使样品带尽可能窄。
3） 洗脱
选择合适的洗脱剂进行洗脱。在洗脱时要控制流速，对于1cm直径的玻璃柱，通常是0.5 ~ 2.0 mL/min。流速太快，分离不好；流速太慢，分离时间太长。洗脱时应注意不让洗脱剂流干，以免影响分离效果。
4） 组分收集和鉴定
对于有色组分，可以直接看到各个分离后的色带；对于无色物质，可以定体积收集流出液，用薄层色谱或其它检测方法鉴定。
分离后的各个组分，可分段洗脱，分别测定；也可以将整条吸附剂从柱中推出，分段切开，分别洗脱后测定。
7.5.3.8 应用举例
● 顺、反偶氮苯的色谱分离（点击）
偶氮苯的顺反异构体可以相互转化，平衡时15~40%的偶氮苯以顺式存在。由于达到平衡速度慢，可用色谱柱分离。采用极性氧化铝柱，石油醚洗脱剂，极性较大的顺式异构体吸附
更强烈，后流出色谱柱。而采用碳黑疏水柱，甲醇洗脱剂，反式异构体吸附更强烈，后流出色谱柱。在445nm等吸收点测定吸光度，可计算平衡常数。
● Th(Ⅳ)、Zr(Ⅳ)和UO22+混合物的反相分配色谱分离（点击） 采用三正辛烷-纤维素色谱柱，分别10 mol.l-1 HCl，6 mol.l-1 HCl和0.05HNO3为洗脱液，可以将Th(Ⅳ)、Zr(Ⅳ)和UO22+很好地分离。
● a，b，g，d--四苯基卟啉（TPP）合成产物的纯化（点击）
TPP粗品溶于氯仿，用f 1.8×12 cm中性氧化铝柱，氯仿淋洗，上部为黄绿色带，下部为紫红色TPP样品带。
● 脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的分配柱色谱分离（点击） 将活性炭用KCN溶液处理，使KCN吸留在活性炭表面，然后装柱。样品液加入色谱柱后，用5 %的苯酚+20 %的乙酸溶液洗脱，芳香族氨基酸在留在色谱柱，而脂肪族氨基酸不被保留。
大孔树脂的柱体积就是指树脂体积与空隙和孔隙的体积之和，其实也就是你所说的圆柱体的体积！
而保留体积是指树脂球体之间的空隙以及球体本身的孔隙的体积，可以通过将树脂湿法装柱后，再让其流干，所
大孔吸附树脂的柱体积，通常都是估算的，就是用来确定洗脱液的用量（水洗6－8个柱体积，醇洗5个柱体积）就在柱子里装等量的水，量出水的体积就行了。