3.加样
取2OμL锰SOD溶液及纯化的大肠杆菌锰SOD加人等体积 40% 蔗糖(内含少量 0.1% 溴酚蓝)。每孔加人上述混合液 4μL ,8μL 及 10μL, 以对称的方式加样 , 以便一分为二 , 分别进行蛋白及酶活性染色。 4、电泳
连接电源, 上槽接负极 , 下槽接正极 ，调节电流至15mA, 待样品由浓缩胶进入分离胶时, 再将电流调至 20-30mA, 当染料前沿距离硅橡胶框 1-2cm 时 , 关闭电源,电泳结束取出胶片 ,一分为二。 5、染色、脱色
(1) 蛋白质染色与脱色 : 染色用 0.05% 考马斯亮蓝 R250 (内含20% 磺基水杨酸),脱色液 7% 乙酸。染色、脱色 , 保存。
(2)SOD 活性染色 : 取另一半凝胶板 , 按下列顺序浸泡于培养皿中染色。
A. 2.45 × 10-3mol/L NBT 溶液 , 在黑暗条件下浸泡 20min 。
B. 3.60 × 10-2mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液( 内含 2.80 × 10-2 mol/LTEMED 和2.8010mol/L×核黄素 ) 中 , 在黑暗条件下浸泡l5min 。
C. 5 × 10mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液，凝胶板移人此液浸泡 , 在 4 × 8W 日光灯下光照 20-30min 。
A B -2
-5
经上述染色和光照后的凝胶板, 在蓝
图 1 SOD 活性与考马斯亮蓝
色背景上出现清晰透明的SOD活性染色带
染色谱带
（见图.1）,图中A为SOD活性染色，透明区
带是SOD抑制NBT光还原的结果，周围无SOD活性的区域在光照后，NBT被还原成蓝紫的甲腾。
注 意 事 项
（1）NBT溶液应置暗处，4oC贮存，以免氧化变质，染色时也置于暗处，如凝胶板厚，则可延长浸泡时间。
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（2）光照应均匀，使无SOD区的NBT充分还原成蓝紫色的甲腾。 思考题
1． 在制备浓缩胶时，核黄素溶液为什么不能和其他成分混在一起抽气？ 2． SOD活性染色原理是什么？
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