细胞色素P450亚酶CYP2D6（AMMC）活性荧光定量检测试剂盒产品说明书
（中文版）
主要用途
细胞色素P450亚酶CYP2D6（AMMC）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过AMMC去甲基化酶反应系统中AMMC转化为AMHC后荧光峰值的变化，即采用荧光法来测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞或组织裂解萃取液样品（动物、人体）或纯化微粒体样品细胞色素P450亚酶2D6的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。
技术背景
细胞色素P450酶是肝细胞微粒体复合功能单加氧化酶系统的总称。其分成五十多个亚酶：CYP1至CYP51。作用在于体内外源化合物（xenobiotics），包括药物、致癌剂、化学污染物的氧化代谢，即单加氧化作用（monooxygenation）和羟化作用（hydroxylation）。AMMC羟基化酶（AMMC 7-hydroxylase）的活性是细胞色素P450亚酶2D6的诊断标记，其基于AMMC羟基化酶选择性催化细胞色素P450亚酶2D6的活性。人体细胞色素P450亚酶2D6（CYP2D6；EC1.14.14.1），主要表达在肝、肾、胎盘、脑、乳腺、肺、和肠道组织中，是肝组织细胞色素P450酶总量的4%。CYP2D6是多态性酶，在80多个等位基因上，出现变异，具有个体和种族差异，与肺癌、肝癌、黑色素瘤、巴金森氏症等疾病发生，以及药物代谢敏感性差异存在相关性。CYP2D6主要代谢三分之一的临床药物，尤其含有碱性氮原子（basic nitrogen atom）的药物，包括异喹胍（debrisoquine）的4-羟基化、鹰爪豆碱（sparteine）的氧化、抗抑郁症药物、神经松弛药（neuroleptic），以及内源性5-羟色胺（hydroxytryptamine）、神经类固醇（neurosteroid）等。同时会产生肝毒性的乙酰苯醌亚胺
（N-acetyl-p-benzyquinone imine）。 基于选择性底物AMMC（3（2（N,N-diethyl-N-methylammonium）-ethyl）7-methoxy-4-methylcoumarin）在CYP2D6的去甲基化（o-demethylation）作用下，转化为AMHC羟基香豆素（3（2（N,N-diethyl-N-methyl ammonium）-ethyl）7-hydroxy-4-methylcoumarin）后荧光峰值的变化（激发波长405nm，散发波长460nm），来定量测定细胞色素P450酶2D6的活性。其反应系统为：
产品内容
缓冲液（Reagent A） 反应液（Reagent B） 底物液（Reagent C） 终止液（Reagent D） 标准液（Reagent E） 产品说明书
毫升 微升
微升 毫升 微升
1份
保存方式
保存在－20℃冰箱里， 反应液（Reeagent B）、 底物液（Reagent C）和 标准液（Reagent E）避免光照； 终止液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月
1
用户自备
1.5毫升离心管：用于标准样品配制和反应的容器 培养箱：用于孵育反应
200微升1厘米光径比色皿或黑色96孔板：用于荧光分析的容器 荧光分光光度仪过荧光酶标仪：用于荧光分析
实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取液或微粒体样品等），置于冰槽里 2． 设定好荧光分光光度仪（温度为37℃）：激发波长405nm，散发波长460nm 3． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管 4． 分别加入xx微升 缓冲液（Reagent A）到每个离心管 5． 移取xx微升 标准液（Reagent E）到1号管，混匀
6． 小心移取xx微升1号管稀释的 标准液（Reagent E）到2号管，混匀 7． 小心移取xx微升2号管稀释的 标准液（Reagent E）到3号管，混匀 8． 小心移取xx微升3号管稀释的 标准液（Reagent E）到4号管，混匀 9． 将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
管号 缓冲液（Reagent A） 标准液（Reagent E） 测定体系 标准AMHC浓度 1 2 3 4 5
二、 标准曲线测定
1． 移取xx微升 缓冲液（Reagent A）到1.5毫升离心管 2． 加入xx微升 反应液（Reagent B） 3． 加入xx微升 底物液（Reagent C） 4． 加入20微升上述配制的标准样品 5． 上下倾倒数次，混匀
6． 在37℃温度下孵育30分钟，避免光照 7． 加入xx微升 终止液（Reagent D），混匀 8． 在37℃温度下孵育5分钟，避免光照 9． 转移到新的比色皿或黑色96孔板
xx微升 xx微升 xx微升 xx微升 xx微升 xx微升 xx微升1号管 xx微升2号管 xx微升3号管 空对照 xx微摩尔/升 xx微摩尔/升 xx微摩尔/升 xx微摩尔/升 0 2
10．即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测，获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU） 11．实际荧光单位：标准样相对荧光读数－5号管标准样荧光读数（作为空对照）
12．构建标准曲线：纵座标（Y轴）为实际相对荧光单位（RFU）；横座标（X轴）为标准AMHC浓度（微
摩尔/升）
三、 样品测定
1． 移取xx微升 缓冲液（Reagent A）到1.5毫升离心管 2． 加入xx微升 反应液（Reagent B） 3． 加入xx微升 底物液（Reagent C）
4． 加入20微升待测样品（20微克微粒体蛋白或100微克细胞裂解萃取液蛋白）（注意：样品须清澈） 5． 上下倾倒数次，混匀
6． 在37℃温度下孵育30分钟，避免光照 7． 加入xx微升 终止液（Reagent D），混匀 8． 在37℃温度下孵育5分钟，避免光照 9． 转移到新的比色皿或黑色96孔板
10．即刻放进荧光分光光度仪或荧光酶标仪检测，获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU） 11．实际荧光单位：样品相对荧光读数－5号管标准样荧光读数（作为空对照） 12．根据标准曲线获得样品对应AMHC浓度（微摩尔/升）
四、 计算样品实际活性
注意事项
1． 本产品为25次操作，包括标准测定 2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，标准液测定只需1次
4． 终止液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全
5． 样品须澄清，至关重要（本公司提供 细胞/组织微粒体组分分离试剂盒 HL18002） 6． 如果酶活性过低，可以增加孵育时间至45分钟（37℃温度下） 7． 荧光测定后，比色皿须清洗彻底
8． 建议待测样本为微粒体，其蛋白浓度为20微克/20微升；待测样本为细胞悬液，其蛋白浓度为100至
200微克/20微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒 HL30030.1） 9． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
10．如果检测血液样品，建议使用 体外非细胞系统细胞色素P450亚酶CYP2D6活性荧光定量检测试剂盒
—— HL18057.2
11．用户可以使用CYP2D6抑制剂奎尼丁（quinidine；IC50=4纳摩尔）作为阴性对照或抑制剂阳性对照 12．细胞色素P450亚酶2D6单位活性定义为：在37℃，pH 7.4条件下，每分钟内能够转化1纳摩尔AMMC
至AMHC所需的酶量作为一个活性单位 13．本公司提供系列毒理学检测试剂产品
质量标准
3
1． 本产品经鉴定性能稳定 2． 本产品经鉴定检测敏感
4