染色质免疫共沉淀（ChIP）
概述
ChIP：chromatinimmunoprecipitation assay，染色质免疫沉淀技术。
研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。 ChIP是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法
原理
在活细胞状态下固定“蛋白质-DNA”复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 ChIP应用
1、检测体内反式因子与DNA的动态作用，研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系； 2、CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-ChIP方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；
3、CHIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点； 4、RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
试验流程一、交联染色质免疫沉淀技术
1. 细胞甲醛交联和收集
注意事项： ①需要优化甲醛使蛋白质和DNA交联的时间。
②交联的时间很关键。交联的时间一般为2-30 分钟。
③交联过度会降低抗原的可结合性和超声的效率，也会被遮盖抗原的表位。
④甘氨酸可抑制甲醛的作用，终止交联反应。
1.1 取 1直径10cm培养皿的细胞。加入甲醛至终浓度为0.75%（V/V），使蛋白和DNA 交联。
1.2 室温下，轻摇10 分钟。
1.3 加入甘氨酸至终浓度为125 mM，室温下放置5 分钟，以终止交联。
1.4 吸去培养基，用冰冷PBS 洗细胞2 次。
1.5 使用细胞刮刀，加入5ml 冰冷PBS， 刮下细胞，收集至一个50 ml 离心管中。
1.6 再用 3 ml 冰冷PBS 洗培养皿2次，至 50ml 离心管中。
1.7 4℃，1000 g，离心5分钟收集细胞。
1.8 吸弃上清，用 SDSLysis Buffer重悬沉淀（每1 X 107 个细胞加 800 μl）。
SDS Lysis Buffer配方： 50 mM HEPES-KOH pH7.5 140 mM NaCl 1 mM EDTA pH8 1% Triton X-100
0.1% Sodium Deoxycholate 0.1% SDS
Protease Inhibitors (每次新鲜加入)
注意事项：使用悬浮细胞实验时，加入0.75% （v/v）的甲醛和甘氨酸后，5分钟，1000g
离心沉淀细胞。冰冷 PBS 洗 3 次，用 SDS Lysis Buffer重悬细胞（每 1 X 107 细胞加 800 μl）。
2. 组织免疫沉淀样品的制备
注意事项：①每个IP反应建议使用肝组织 30 mg，可按实际情况调整。
②每种组织的用量依据组织蛋白丰度、抗体亲和力和交联效率而定。
③每个IP反应最适染色质的量为5-15 μg 。 ④每次交联免疫沉淀反应之前，需根据不同组织类型确定具体的染色质需要量。
⑤所有溶液中均应添加蛋白酶抑制剂protein inhibiter （cocktail）。 2.1. 交联反应
注意事项： ①冰冻组织应置于冰上融化。
②冰冻组织融化时温度不能过高，以免蛋白酶活化使组织降解。 ③操作过程中要一直在冰上进行，尽量缩短操作时间防止蛋白降解。
2.1.1.将冰冻或新鲜组织切成小块(1-3 mm3) 。
2.1.2. 取一个空的15 ml 离心管，称重，放入组织后再次称重，计算组织重量。
2.1.3.每克组织加10 ml PBS。加入终溶度1.5% (v/v) 的甲醛，室温旋转15 分钟。
2.1.4. 加入甘氨酸至终浓度0.125M，终止交联反应，室温旋转5 分钟。
2.1.5. 4 °C，720 rpm，离心 5min。
2.1.6. 弃上清，用加入10ml 预冷的PBS 洗涤。4°C，720rpm，离心5 min，弃上清。
注意事项： ①所得组织可用液氮速冻，保存于 -80 °C。 ②避免反复冻融。
③使用时可用预冷PBS 重悬组织，每克组织加10 ml，置冰上解冻。
2.2.降解组织
2.2.1. 剪掉1 ml 枪头的末端，使吸头口增大。
2.2.2. 用1ml PBS 重悬50-100 mg组织。
2.2.3. 将溶液加入锥形研磨管中，研磨2 分钟。
2.2.4. 用1 ml 注射器连接18号钝圆针头，插入研磨管中收集细胞。将细胞加入一个锥形管中，冰上放置。
2.2.5. 显微镜下观察细胞悬液，以确定得到的是单细胞悬液。
2.2.6. 1000 rpm, 4 °C，离心 10 分钟收集细胞。
2.2.7. 弃上清，用SDSLysis buffer重悬沉淀（每1x107 个细胞加入 800 μl）。
2.2.8. 超声处理。 3. 超声
3.1超声处理裂解液，将DNA打断成500-1000 bp 范围内的片段。
注意事项： ①使用组织进行实验时，要得到单细胞悬液，需从超声处理开始。 ②细胞系不同，需要超声的时间也不同，需要分别优化得到最佳条件。
③取部分样本使用1.5%（质量百分比）的琼脂糖凝胶电泳，分析超声结果。
33.2 超声处理后，4°C，10，000 g ，离心 10min，以除去细胞碎片。转移上清至新管中。
3.3 超声后的样本各取50 μl，测量DNA 浓度，用为PCR 对照。
注意事项：①超声后溶液可在液氮中速冻，可于 -80 °C保存 2 个月。 ②避免反复冻融，以免样品降解。
③超声时间过长会使核小体与DNA 的交联断裂，一般超声时间为15min。 4. 纯化DNA4.1 试剂盒纯化DNA
①加入 2 μlRNA 酶A (0.5 mg/ml)。 ②65 °C ，4-5小时（或过夜），解交联。 ③按照 DNA纯化试剂盒说明书纯化DNA。 ④样本可于 -20°C保存。
注意事项：使用 DNA 纯化试剂盒纯化 DNA 时，应加入 RNA 酶 A 处理样品，以免RNA 浓度过高减少 DNA 的最终纯化量。
4.2 酚:氯仿抽提纯化DNA ①加入 5μl 蛋白酶K (20mg/ml)。 ②65°C ，4-5 小时（或过夜），解交联。 ③等体积酚:氯仿抽提 DNA样品3次。
④取水相加入 10μl 糖原(5mg/ml)，2倍体积无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥10min。
⑤加入100 μl水溶解沉淀。 ⑥样本可于 -20°C 保存。
注意事项：使用蛋白酶 K 消化样品，可以水解蛋白质，使蛋白质与DNA 解交联，以促进DNA 的纯化。
4.3 DNA 浓度测定
①取 5 μl 纯化 DNA， 稀释200倍，测定OD 260。
②DNA 浓度（μg/ml）=OD260x 10,000，计算DNA浓度。 5. 免疫沉淀
5.1. 使用超声处理所得溶液进行免疫沉淀反应。 建议： ①沉淀反应 DNA 含量约为 25 μg 。
②每个样本用RIPA 缓冲液 稀释10倍。
③设一个抗体对照和一个仅加磁珠（不加抗体）的对照。
RIPA buffer配方： 50 mM Tris-HCl pH8 150 mM NaCl 2 mM EDTA pH8 1% NP-40
0.5% Sodium Deoxycholate 0.1% SDS
Protease Inhibitors (每次新鲜加入)
5.2.样本中均加入一抗（对照样品不加）。
注意事项： ①先进行预实验得到最佳的抗体加入量。
②每 25 μgDNA 一般加入1-10 μg 抗体。
5.3.样品中加入20 μl 的 protein A/G 磁珠，免疫沉淀（IP），4 °C，缓慢旋转过夜。
5.4. 2000g离心1min收集磁珠，弃上清。
5.5. 用1 ml 低盐washbuffer洗涤磁珠3 次。2000g离心1 分钟。 低盐Washbuffer配方： 0.1% SDS
1% Triton X-100 2 mM EDTA pH8 150 mM NaCl
20 mM Tris-HCl pH8
5.6. 用高盐washbuffer洗1 次。2000g离心1 分钟。
高盐washbuffer配方： 0.1% SDS
1% Triton X-100 2 mM EDTA pH8 500 mM NaCl
20 mM Tris-HCl pH8
注意事项： ①如果背景过高，则应增加洗涤次数。
②超声处理后的染色质先与proteinA/G 磁珠共孵育1 小时，将消除与磁珠的非 特异行结合，降低背景。 6. 免疫复合物洗涤和解交联 6.1 回收DNA：向 protein A/G 磁珠中加入 120 μl Extraction buffer，30 °C， 旋转15 分钟。
Extraction buffer配方： 1% SDS
100mM NaHCO3
6.2 2000g 离心1 分钟。将上清转移至新管中。样本可于-20 °C 保存。
6.3. 纯化DNA 可用 DNA纯化试剂盒或酚:氯仿抽提进行（参照上面步骤）。
6.4. DNA 可用Realtime-PCR进行定量检测。 二、 ChIP 常见问题
1. ChIP是什么？
答：染色质免疫沉淀技术（ChromatinImmunoprecipitation，简称ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。