三、上机分析流程
建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品。 （1）Negative Control（不加任何抗体）。 （2）CD3-FITC（FL1 单染）。 （3）CD19-PE（FL2 单染）。
（4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 双染）。
1. 先开启细胞仪本体再打开计算机。 *秘技1：如顺序相反，仪器和计算机之间无法建立正常通讯，无法执行―connect to cytometer”。 解决之道，两者都关机、然后以正确方式重开。
2. 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，将减压阀方向调在VENT位置（箭头方向）。
3. 仪器会对鞘流液筒打气加压，请确认筒盖确实旋紧。 *秘技2：将减压阀方向调在加压（向前）位置。减压阀如在VENT（箭头方向）位置，按RUN功能键时将显示橙黄色（表示仪器不正常，请检查是否失压），正常为绿色显示。
4. 在苹果菜单下点击CELLQuest 启动软件。桌面会出现一‘Untitled‘ 实验文件，可点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。
3.2开启CellQuest 软件、编辑实验文件 3.1 Calibur 开机
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5. 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框。
6. 在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选择Acquisition (收取) ，确认X和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。在颜色方框中点击Multicolor Gating（收取样品时，门内细胞将出现颜色）。点击OK。此时实验文件会出现FSC/SSC散点图。
7. 说明：散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显示两个独立参数的相互关系。在图中，横坐标X轴为为荧光1强度的相对值，单位是道数，纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。第一图X和Y轴参数分别设为FSC-H 1024、SSC-H 1024；第二图X和Y轴参数分别设为FL1-H 1024、FL2-H 1024。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC：细胞大小，SSC：细胞折射率，FL1：FITC绿色荧光，FL2：PE橙色荧光，FL3：PerCP红色荧光）。
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8. 从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，在出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024，Y轴：FL2-H 1024。点击OK，FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。
9. 在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设定在（x，y）＝（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域。
10. 从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer，此时会出现Acquisition Control 对话方框。如果无法选择Connect to Cytometer，参考秘技 #1。如果没见到Acquisition Control 对话，可到屏幕上方Windows菜单中选择Show Acquisition Control。
建立仪器和计算机之间通讯
注意：实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件（Instrument settings），含信号器高压（Detector/ Amps），阈值
（Threshold），荧光补偿（Compensation）等仪器条件的组合。一般而言，仪器设定的顺序为Detector/Amps -- Threshold -- Compensation。
仪器设置文件
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11. 检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps窗口。在Detectors/Amps窗口确认FSC与SSC为LIN（线性放大），其它FL1-3为LOG（对数放大），将其拖至空白区。
12. 从Cytometer菜单中选择Threshold，出现 Threshold 窗口在Threshold 窗口：确认FSC为设阈参数，初步确认预设阈值52。将其拖至空白区。
13. 从Cytometer菜单中选择Compensation，确认所有预设数值皆为零。将其拖至空白区。
14. 使仪器处于High RUN，支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。确认Acquisition Control 窗口中? Setup前需打叉或打勾 (即不储存数据)，点击Acquire。
3.3 上样品、设置仪器
15. 观察FSC/SSC图的变化。FSC电压(Voltage)预设为E00，可调节 Amp Gain 从1.00—9.99 使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC电压设置于E-1；较小细胞，将FSC电压设置于E01）。调节SSC电压使主要细胞群得以清楚呈现。调节FSC/SSC图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。调整定位后，点击Acquisition Control 窗口中的Pause。
调节FSC/SSC探测器（电压）
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Gating 圈选
细胞检品中，常含有大小不同、性质相异的细胞群体。我们常用前方散射与侧方散射的二维位图，即散射光图谱（Scatter Plot），来圈选出不同细胞群的范围，选择性显示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。
16. 在工具板中选择多边形的Region，在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1 区域（如下图）。分析样品时，区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。如果要删除R1区域，您可以在工具列中点选Gates → Region list ，以鼠标点选 R1，再按Delete 键删除R1 区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。
17. 选取希望Gate的FL1/FL2散点图，从Plots菜单中选择Format dot plot。在出现的对话方框内，将No Gate 改选 G1=R1。点击OK。
18. 点击Acquisition Control 窗口中的Restart。在Detector/Amps 窗口中调节
FL1、FL2的电压，使Negative Control细胞群着落在所选直方图或散点图之100--101处。
调节FL1、FL2的探测器（电压）
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