烟叶中游离氨基酸总量的测定
一、原理 游氨基酸可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物。在一定范围内，颜色的深浅游离氨基酸含
量成正比，可用分光光度计，在570nm下测得蓝紫色溶液的消光值，根据标准曲线计算未知样品中游离氨基酸的含量。 二、实验材料、仪器和试剂
1. 材料 新鲜烟叶 2. 仪器
（1）研钵、漏斗、三角瓶、滤纸 （2）具塞刻度试管20ml
（3）刻度吸管（5ml、1ml、移液枪0.1ml） （4）沸水浴电炉 （5）分光光度计 3. 试剂
（1）10％乙酸
（2）水合茚三酮试剂：称取0.6g茚三酮加入15ml正丙醇溶解，再加入30ml正丁醇及60ml乙二醇，最后加入9mlpH4.5乙酸—乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶于冰箱内保存，10日内有效。 （3）乙酸—乙酸钠缓冲液（PH4.5）：称取54g乙酸钠(NaAc·3H2O)，加入蒸馏水加热至沸，冷却后加30ml冰乙酸，用蒸馏水定容至100ml。
（4）氨基酸标准液：称取80℃烘干的亮氨酸46.8mg，以10％异丙醇溶解，并定容至100ml，取此液5ml用蒸馏水稀释至50ml，即为每毫升含氮5ug的标准液。 （5）0.1％的抗坏血酸：50mg溶于50ml水中，现用现配 （6）60％乙醇
三、操作步骤
1. 样品提取
取新鲜待测烟叶，剪碎，于研钵中加5ml10％乙酸，研磨，转移至100ml容量瓶中，用蒸馏水定容后，用干滤纸过滤至三角瓶中。
2. 标准曲线制作
取6支20ml刻度试管，按表加入试剂后，盖上玻塞，混匀，置沸水浴中15分钟，然后取出在冷水浴中迅速冷却，使加热时形成的红色逐渐被空气氧化而褪色，直到溶液呈蓝蓝紫色时，用60％乙醇定容至20ml，摇匀，在570nm下测消光值。以每管含氮量为横坐标，消光值为纵坐标作标准曲线。
试剂 标准亮氨酸 无氨蒸馏水 水合茚三酮试剂 0.1％抗坏血酸 每管含氮量（ug）
管号
1 0 2.0 3.0 0.1 0
2 0.2 1.8 3.0 0.1 1.0
3 0.4 1.6 3.0 0.1 2.0
4 0.6 1.4 3.0 0.1 3.0
5 0.8 1.2 3.0 0.1 4.0
6 1.0 1 3.0 0.1 5.0
3. 样品测定
取样品滤液1ml，放入20ml具塞刻度试管中，加蒸馏水1ml，水合茚三酮3ml，0.1％抗坏血酸0.1ml，同标准曲线方法显色、比色。根据消光值在标准曲线上查的样品的含氮量X（ug） 四、结果计算
按下式计算出100g鲜样中氨基酸的含量：
X（ug）╳ 氨基酸含量（mg/100g鲜样）＝ 样品提取液总体积 测定所取滤液体积 ╳100 样品重（g）╳100 五、注意事项
比色应在显色后1小时内进行；实验用水为无氨水；严格掌握抗坏血酸用量
注：缓冲液配制时可适当加热，以防结晶（乙酸-乙酸钠）（最好用无离子水）； 配制水和茚三酮时，将所有醇加入后再溶解（盖盖子）； 用定量滤纸（7或9cm）；
过滤首次将滤液倒掉，以达到润洗三角瓶（或塑料盒等）及滤纸的目的； 抗坏血酸现用现配，贮于容量瓶中。