HPV疫苗的制备及作用效果
HPV 是一类能够感染皮肤和粘膜的 DNA病毒。高危型 HPV是宫颈癌以及癌前病变的要致病因子，99.7%的宫颈癌组织都检测出高危型 HPV。
针对 HPV 感染，人类自身所产生的免疫应答主要分为体液免疫和细胞免疫。体液免疫主要表现为 HPV 刺激机体 B 细胞产生抗 HPV L1、L2 蛋白的抗体，但是由于产生抗体的量特别少，所以很难检测到这些特异性抗体，阻碍了人们对体液免疫的相关研究。细胞免疫主要表现为 T 细胞受 HPV 刺激后通过释放淋巴因子来杀死感染病毒的细胞[1, 2]。
目前预防和治疗 HPV 相关癌症最有效的方法是研制其特异性的 HPV疫苗，诱导机体产生中和抗体，激发保护性免疫反应，以达到预防 HPV 相关癌症发生和传播的目的，既可以降低宫颈癌的发病率，也可降低与 HPV 感染有关的其它癌症的发病率。
人类乳头瘤病毒（HPV）是一种无包膜的双链闭环小分子DNA 病毒，属乳头多瘤空病毒科乳头瘤病毒属。其基因约8kb， 只有1 条DNA 链可作为转录模板，含8 个开放阅读框（open reading frames，ORFs）， 分3个基因区，即早期区( early region，E 区)、晚期区（late region，L 区） 与非编码区（uncoding region，UCR） 或上游调控区（URR）。E 区编码E1，E2，E4，E5，E6，E7 等早期蛋白，参与病毒DNA 的复制、转录、翻译调控和转化等功能；L区编码主要衣壳蛋白L1 和次要衣壳蛋白L2； UCR 区含有HPV 基因组复制起点和HPV 表达所必需的调控元件。由ＨＰＶ产生的两种癌蛋白是Ｅ6和Ｅ7，可以抑制细胞周期负调节因子的活性，并可以在肿瘤细胞中高度表达。而晚期基因则编码衣壳的结构蛋白，其中主要衣壳蛋白Ｌ1结构保守，是ＨＰＶ衣壳的主要成分，约占衣壳蛋白的80%以上，因此成为理想的预防免疫靶位。基于HPV的致病机制和天然的免疫原性，HPV疫苗研究聚焦于L1、E2、E5、E6 和E7。
目前HPV的疫苗主要分为预防性疫苗和治疗性疫苗。预防性疫苗主要诱导机体体液免疫反应，产生的中和性抗体在HPV 进入机体前即能与病毒的抗原结合，从而防止HPV 的感染。治疗性疫苗主要引起机体的细胞免疫反应，产生的活化效应性T 细胞能识别和攻击HPV 感染的细胞，其中也包括HPV 引起的恶性肿瘤细胞。
（一）HPV预防性疫苗
1.预防性疫苗的制备依据及过程
预防性疫苗一般以HPV主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2为靶抗原[3], 其作用在于诱发肌体产生特异性的中和抗体和有效的局部免疫反应, 以阻止HPV 的长期感染和再感染。HPV 的衣壳蛋白在真核以及原核表达系统中表达时, 能自我装配或形成病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs), 其结构和抗原表位与天然的病毒颗粒十分相似，将其置入机体后可刺激产生中和抗体 IgG 和 IgA[4]，达到预防相应型别HPV 的感染，而且不包括病毒 DNA，安全性好，能有效地保护人类和动物免受乳头瘤病毒的感染以及产生相关肿瘤的可能性[5,6]。VLPs 颗粒直径为50-55nm，分子量为55-60kDa，VLPs是由纯化的L1 蛋白装配形成HPV 的空衣壳。VLPs 的最小结构单元是 L1 蛋白单体，L1 蛋白主要是由 8 条反向平行的β折叠肽链段构成的，它们之间是由无规则的环形区（loop）连接在一起的，每个环形区大约有 10~30 个氨基酸（aa），这些区域绝大部分延伸到五聚体和病毒颗粒的外表面，是抗原表位的所在区域[7-9]；不同型别 HPV 环形区的序列和空间结构是不同的，所以 HPV 具有高度的型别特异性。因此，目前对于 HPV 抗原表位的研究主要集中在 L1 蛋白的环形区上[10]。
国内外有多家机构在进行HPV疫苗的研究及其制备，大部分都是以L1和（或）L2蛋白为靶标进行制备的（单独表达L1或者联合表达L1+L2，获得病毒样颗粒(VLP)）。一般步骤都是针对HPV L1和（或）L2蛋白的核酸序列为基础，对其进行改造优化（例如密码
子优化，删除部分序列，替换某个/些碱基，连接其他基因等），扩增或者合成优化后的序列，然后将其克隆到表达载体上，并在原核系统（例如大肠杆菌）或者真核系统（例如昆虫细胞，酵母，哺乳动物细胞等）进行表达，再将表达的单个蛋白或者融合蛋白分离纯化，添加佐剂后制成疫苗，通过将制成的疫苗免疫小鼠或者其他动物对其免疫原性进行评价，效果较好的进行临床实验。
2.已经被批准上市的预防性疫苗
目前已经被批准上市的预防性HPV疫苗有两种，它们分别是英国葛兰素（GlaxoSmithKline，GSK）公司的双价疫苗“Cervarix”和美国默克（Merck & Co., Inc.）公司生产的四价疫苗“Gardasil”（商品名）[11]。随着这两种疫苗的上市，人们对宫颈癌疫苗的研究主要集中在 HPV VLPs 疫苗上。2006 年，“Gardasil”被批准上市，这是第一个商品化的宫颈癌预防性疫苗，它是由两个高危型HPV16、18 和两个低危型 HPV6、11 的 L1-VLPs 组成的重组混合型疫苗，它们使用酿酒酵母体系产生 VLPs，佐剂为氢氧化铝（225ug）。2007 年，英国葛兰素公司的“Cervarix”（商品名）疫苗上市[12，它是 HPV16、18 的 L1-VLPs 组成的重组混合型疫苗，利用重组杆状病毒感染的昆虫细胞(粉纹夜蛾）产生VLPs，佐剂为传统铝盐（500ug）加上AS04(50ug)[13, 14]。这两种疫苗都是预防性的，不是治疗性的，主要接种于未发生HPV感染的人群，用来预防 HPV感染以及相关疾病的发生。这两种疫苗的抗原都是HPV主要衣壳蛋白的L1。临床试验结果证明，上述疫苗均具有良好的耐受性，且没有严重的不良反应，抗体效价比自然感染HPV的患者高50倍。此外，最近Merck公司又研发出了Gardasil九价预防性疫苗（HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58）。Gardasil 已在117 个国家或地区被批准使用，全球33个国家多中心的联合试验结果表明，疫苗对宫颈癌、癌前病变以及其他生殖道疾病的预防作用可达99% ～100%；Cervarix疫苗对HPV16 和HPV18 所致CIN Ⅱ、Ⅲ的保护效力达到100%；Merck公司的九价疫苗已经于2015年进入三期临床试验。二价疫苗针对HPV16、18 产生的保护性抗体均可维持100%的血清阳性至少8.4 年[15]；四价疫苗针对HPV16 产生的保护性抗体能维持98.8%的血清阳性至少5年[]16]。
3.其他处于研究阶段的预防性疫苗（部分）
Xie等[17]在杆状病毒昆虫细胞中表达纯化了 HPV 16,18,58 LI VLPs，对各型VLPs进行了纯度、形态学及免疫原性的研究，特别是HPV58L1 VLPs诱发长期中和抗体活性及协同A1(0H)3佐剂的相关研究。在此基础上，表达及纯化了以HPV16L1 VLPs为载体的嵌合各种HPV 16 L2保守表位的杂合蛋白，并对影响杂合L1组装能力及其诱发中和抗体活性的因素进行了研究。HPV LI VLPs免疫小鼠测定ED50，将HPV 16,18,58 LI VLPs单独或混合免疫小鼠诱发了较高滴度的针对组成型别的中和抗体，表明HPV16,18,58 LI VLPs免疫原性很强。
韩国的金洪珍等[18]通过优化16型和18型的HPV序列，构建至pUCminvsMCS载体及YEG-MCS酵母表达载体，以酿酒酵母为宿主菌进行表达，通过肝素层析和阳离子交换层析进行表达蛋白的纯化并进行浓缩。纯化得到的蛋白添加佐剂后免疫小鼠，发现组合佐剂增加了免疫刺激效果，总IgG 效价增高。该药物疫苗组合物可比常规疫苗( 包括CervarixTM 及GardasilTM) 诱导更强的针对HPV 的免疫应答，因而具有优良的宫颈癌预防功效。此外，该药物疫苗组合物由于用作免疫佐剂的脱酰基化的非毒性LOS 几乎无细胞毒性而具有优良安全性。该药物疫苗组合物比施用 CervarixTM 及GardasilTM 显著提高与Th1 型免疫应答( 细胞免疫) 相关的干扰素-γ、IgG2a 及IgG2b 水平，以及与Th2 型免疫应答( 体液免疫) 相关的IgG1 水平。总体来说，本药物疫苗组合物可诱导均优于CervarixTM 及GardasilTM 的针对HPV 的Th1 型免疫应答( 细胞免疫) 及Th2 型免疫应答( 体液免疫)。
厦门大学的李少伟等[19]对全长HPV31L1 基因依照大肠杆菌密码子偏嗜性进行优化
（片段全长为1515bp，终止密码子为TAA），由上海博亚公司合成该基因，酶切后与非融合表达载体pTO-T7连接，转入ER2566大肠杆菌，用50L的发酵罐进行大规模培养，用IPTG 进行诱导表达，之后分离纯化（HPV31Ctag-L1 的阳离子交换色谱）L1蛋白，对得到的蛋白通过Western和质谱进行鉴定，用CENTRASETTE5切向流系统对L1蛋白进行组装，对HPV31L1 病毒样颗粒进行透射电镜观察和动态光散射检测。将制得的该病毒样颗粒稀释至0.1mg/ml，然后加入等体积的完全弗氏佐剂等体积的不完全弗氏佐剂，免疫小鼠/兔子后进行免疫保护性的评价。发现通过该方法获得的HPV31-L1 病毒样颗粒具有良好的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的中和抗体，从而可用作预防HPV31感染的疫苗。
马润林等[20]克隆了HPV16 L1衣壳蛋白基因，进行修饰(碱基替代)后在大肠杆菌中表达（表达质粒为pGEX-6-1，表达菌株为BL21），分离，经亲和色谱纯化重组HPV16L1蛋白五聚体（该五聚体与HPV16 L1蛋白的VLP具有相同的免疫原性和抗原性），将所得重组HPV16 L1蛋白五聚体与辅料（佐剂包括吕盐/3-O-去酰化单磷酸类脂/脂质A衍生物，赋型剂包括生理水以及其它药物上可接受的赋型剂，稳定剂包括基于磷酸盐的生理缓冲液）混合制剂，得到16型重组人乳头瘤病毒疫苗。具体步骤为将纯化的HPV16 L1的五聚体与100mM NaCl的标准磷酸缓冲液混合（pH7.2），加入150ug氢氧化铝，调整五聚体浓度至10ug/支，制成疫苗。动物安全性实验发现重组HPV16疫苗对供试动物未发现任何可观测到的急性毒性和异常毒性，全部毒性检测指标为阴性。动物有效性试验发现组HPV16疫苗能诱导供试动物产生强烈的抗体保护反应，抗体有效中浓度ED0在0.4-2.0微克，抗原的免疫原性及抗体的滴度水平很高。 （二）HPV治疗性疫苗
在感染HPV所引起的的恶性肿瘤细胞中，病毒DNA整合到宿主细胞DNA中，结果导致 E6、E7 基因异常过量表达而使细胞无限增殖，并最终向恶性转化；同时，晚期蛋白 L1、L2 基因会断裂丢失，使其不能表达或仅有部分蛋白被低水平表达而难以检测到，因此预防性疫苗对已经感染 HPV 并引起癌前病变的的患者没有保护能力，不能使他们被治愈。研究表明，HPV 感染引发的癌前病变以及癌症的发生主要是由 HPV E6、E7 的协同作用所致，因此针对 E6、E7 为靶抗原的HPV治疗性疫苗成为研究的重点[21, 22,23, 24]。
1.治疗性疫苗的制备主要依据 由于HPV E6/E7蛋白具有致癌性，将这两种蛋白直接应用于治疗宫颈癌时会存在疫苗的安全隐患，通常对关键位点进行突变以降低致癌性。通过对HPV E6蛋白和E7蛋白结构功能和突变体的深入研究，可以有靶向性地对E6和E7基因进行突变和改造，消除E6蛋白和E7蛋白的致癌能力和转化活性，从而降低了将HPV E6/E7蛋白应用于治疗性疫苗开发的风险，保证安全性。对HPV E6/E7基因进行突变，使其失去致癌性，同时保留免疫原性是研制宫颈癌治疗性疫苗的主要手段之一[25]。 2.治疗性疫苗的种类及制备
HPV治疗性疫苗的类型主要有：多肽/蛋白质疫苗[26]、活病毒载体疫苗 、DNA 疫苗、RNA疫苗[27]。目前尚无有效的 HPV 治疗性疫苗问世。 但重组蛋白疫苗、多肽疫苗已进入二期临床试验，并显示出良好的前景。
蛋白疫苗：多肽/蛋白疫苗是采用肿瘤特异性的多肽片段或抗原蛋白作为疫苗直接免疫机体，诱导机体产生抗原特异性的CTL反应来杀伤肿瘤细胞。Chen等首先证实，HPV16 E7免疫动物可获得特异性CD8 阳性淋巴细胞介导的肿瘤排斥反应。Bermudez Humaran 等［28］通过乳酸乳球菌生产HPV16 E7蛋白。
多肽疫苗：多肽疫苗的作用原理与蛋白疫苗类似。Liu 等构建了一种新型的疫苗E7 蛋白CTL 表位44 ～ 62 和热休克蛋白( Hsp70 ) 的融合多肽疫苗［29］，使用rAAV 作为载体，动物实验中显示出良好的肿瘤保护作用，转染效率高，且使用rAAV 可使作用延至l5 年，
避免反复使用及由此产生的中和抗体。
活载体疫苗：活载体疫苗是将肿瘤特异性抗原蛋白的基因插入活载体（细菌或病毒等），高效表达抗原从而刺激抗原特异性的免疫反应。活载体疫苗免疫原性高，作为抗原载体的免疫刺激效果好。但是，活载体可能有潜在的安全风险，尤其是对于免疫功能不全的患者。常用疫苗的载体主要有病毒（牛痘病毒、腺病毒、腺相关病毒和α病毒等），细菌等。Li等[30]采用天坛牛痘株构建了表达HPV16和18 E6/E7蛋白的重组牛痘病毒疫苗rVVJ 16/18 E7E6，在对小鼠和恒河猴的研究中，该疫苗均显示细胞免疫反应，而且对小鼠的肿瘤移植保护实验也显示出一定的效果。田厚等[31]，将HPV16 型早期蛋白E7、E6 编码区基因融合，并将E7、E6 编码区基因进行改造修饰去除其转化活性，保留抗原性，再根据哺乳细胞使用密码子的偏嗜性设计其相应的优势密码子核酸序列交给公司合成。将合成的经密码子优化过的E7E6 融合基因插入到腺病毒重组载体质粒pCD316中，与Ad5 病毒载体骨架质粒共转染293 细胞，经纯化并进行E7E6 融合基因及蛋白的鉴定，筛选出表达人乳头瘤病毒HPV16 型E7E6 融合蛋白的重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6，扩增重组病毒，经动物免疫实验评价，表明所制备出的重组腺病毒rAd5HPV16SmE7E6 具有免疫活性，其能够诱发免疫动物产生针对HPV16E7 的特异性T 细胞介导的细胞免疫应答，对肿瘤的生长有明显抑制作用。
DNA疫苗：Smahel 等使用修饰了的HPV16 E7 基因DNA 疫苗进行体外实验［32］，在E7 基因Rb 结合点加入3个突变位点GGG，实验对比4 种疫苗的作用: E7、ETGGG 及2 种融合基因L16c E 、Sig /EAMP － I。结果显示，E GGG 免疫原性明显优于E7和LISC E7 ( 1 ～ 60) ，与g /ET/LAMP － 1相似，合用不能提高免疫原性。修饰的DNA 疫苗不仅去除了癌基因的结合位点，而且并不影响其免疫原性，实验中引入的基因枪介导的皮内注射优于肌肉注射。周玉柏等[33]通过用哺乳动物高频使用的密码子取代HPV16，18L1 基因序列的密码子而得到密码子优化型HPV16，18L1 基因，将该基因克隆到质粒VR-1012中，得到携带密码子优化型HPV16，18L1 基因序列的重组DNA 疫苗；采用初免-加强策略肌注Balb/c小鼠，检测免疫效果：pVR-HPV16L1和pVR-HPV18L1产生的抗体效价分别达到800及640，表明重组DNA 疫苗能在BALB/c小鼠体内诱导较高的体液免疫应答；HPV16型别中1×106 的脾淋巴细胞中的斑点数达到2070，HPV18 型别中1×106 的脾淋巴细胞中的斑点数达到500 以上，表明重组疫苗能在BALB/C H-2Kd 小鼠体内诱导较高的细胞免疫应答。
RNA疫苗：Cheng 等在动物实验中使用辛德毕斯病毒自身复制RNA 载体( SIN－rep5) ［34]，并比较针对不同定位靶E7蛋白的疫苗效果，核E7蛋白、分泌的E7 蛋白( Sig /E7) 、定位于溶酶体的溶酶体相关膜蛋白1和E7 蛋白的联合体( LAMP－I/ET) 。结果显示，三者均有很强的抗肿瘤作用，尤其是LAMP－I/E，LAMP－I可增强RNA 疫苗的使用潜能，机制涉及CIM阳性和CD8 阳性T 细胞以及NK 细胞。